开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题的研究背景、意义和目的
恶性肿瘤目前仍然是全球排名第二的致死性疾病[1]，与恶性肿瘤的常规治疗方法如手术、化疗和放疗等不同，分子靶向治疗作为肿瘤治疗的新手段，正以其良好的疗效、显著的耐受性以及高度特异性等优势在临床上取得广泛的应用，目前已有多种抗肿瘤分子靶向药物在国内外上市，但同时靶向药仍存在许多毒性反应，常见分类有皮肤毒性、消化道不良反应、心血管毒性、肝毒性反应等[2]。
本次实验使用的KRAS靶点抑制药ZY-293即是一类小分子抗肿瘤靶向药物。KRAS基因属于RAS家族，是人类癌症中常见的基因突变之一，其编码的蛋白是一种小GTP酶。突变型KRAS功能异常，持续保持与GTP结合的活化状态，导致细胞内信号传导紊乱，启动下游信号传导，细胞增殖失控而癌变[3]。KRASG12C特指KRAS的12位Gly突变为半胱氨酸(cysteine,Cys,C)，约13%的肺癌和3%的结肠癌中存在该突变。本试验所用药物ZY-293通过直接靶向KRASG12C达到抑制癌症的效果。
该项研究计划采用最大给药量法进行给药，目的在于观察Beagle犬单次灌胃给予ZY-293可能出现的毒性反应及其类别，药后对临床观察、给药、体重、食量、体温、临床病理等指标进行检查与记录，并对动物进行解剖，进行大体解剖观察。实验结束之后整理总结试验数据及分析各项指标，对ZY-293进行安全性评价，判断毒性反应与该药物的相关性，初步判断可能的毒性靶器官/组织，估算临床初始量和安全范围，以及为临床急性毒性反应监测及防治提供参考。
二、实验内容
1、动物分组和给药剂量：
根据给药前（D-2）测定的动物体重，选择体重相近的动物，使用计算机系统将动物按性别区段随机分为如下4组：
|
组别 |
供试品 |
剂量 |
浓度（mg/ml） |
动物数只/性别 |
动物号 |
|
|
雄 |
雌 |
|||||
|
1 |
溶媒对照品 |
0 |
0 |
1 |
A-1 |
A-2 |
|
2 |
ZY-293 |
150 |
10 |
1 |
B-1 |
B-2 |
|
3 |
ZY-293 |
500 |
33 |
1 |
C-1 |
C-2 |
|
4 |
ZY-293 |
1500 |
100 |
1 |
D-1 |
D-2 |
2、给药：
2.1给药途径：灌胃给药
2.2给药频率：D1给药一次
2.3给药容量：15ml/kg
2.4给药方法：1~4组所有动物，使用合适的注射器及灌胃管经口灌胃给予供试品或对照品。每只动物的给药量需要根据药前最近测定的体重确定。给药体积保留小数点后一位。给药前至少15分钟及给药过程中供试品处于搅拌状态以确保混悬液外观均一。
3、禁食：
1~4组动物给药前需禁食过夜，药后禁食3~4小时，在做生化指标前禁食过夜。
4、临床观察：
4.1 给药当天后笼旁观察（D1）
观察频率和时间：1~4组动物给药后笼旁观察急性毒性反应至少4小时，对未表现处明显异常反应的动物，4小时后结束观察；对表现出明显异常变现的动物，应进行详细临床观察。
4.2 一般临床观察
所有动物试验期间每天至少2次（上午和下午各观察1次），观察死亡、发病、精神状态、行为活动、神经反应、呼吸、分泌物、粪便以及饮食、饮水情况等。
5、体重：
动物分组前，1~4组动物试验期间每周1次；1~4组动物计划安乐死前，所有动物发现死亡或濒死安乐死时均需称重。
6、食量：
给药后每天对1~4组动物进行1次摄食量测定，以g/只/天形式体现，禁食当天的食量不用计算。
7、体温：
所有动物于给药前、药后2~4小时、D7、D14测量体温。
8、临床病理：
第1~4组动物于给药前（D-1）、D2、D8、D15从前肢或后肢皮下静脉采集血样用于血细胞计数、凝血功能、血液生化的检测。动物禁食过夜，分别收集约1、2、2ml血样，分别装在含有EDTA-K2抗凝剂（血细胞计数）、枸橼酸钠（凝血功能）和无抗凝剂（血液生化）的采样管中，使用机构内配备的专业化仪器进行各类生化指标的检测。
9、动物安乐死：
于D15将动物采用盐酸氯胺酮注射液（20mg/kg，50mg/kg）肌肉注射，再用盐酸塞拉嗪（1mg/kg，20mg/kg）肌肉注射麻醉动物，通过股动脉放血法将动物实施安乐死。
10、大体和组织病理学检查：
所有死亡动物均进行解剖，观察动物的体表及体表孔窍、头颅、胸部、腹部、骨盆等处以及其内容物是否有异常。异常组织/器官放入10%中性福尔马林缓冲溶液中固定后，进行常规石蜡包埋、切片及HE染色，并进行组织病理学观察。
11、数据采集及分析：
试验所需数据如临床观察、给药、体重、食量、体温及临床病理指标经过数据采集后整理并进行数据分析。
12、试验结果总结。
三、进度安排
本实验计划3月份进行给药，3月底动物试验结束，4月份完成各项指标分析及总结报告，具体安排如下：
2020年3月 了解课题内容，查阅相关文献，书写开题报告；
2020年3月~4月 按照试验方案开始给药并进行动物试验；
2020年4月~5月 进行对各项试验数据及指标的整理及分析；
2020年5月~6月 总结资料，撰写论文，答辩。
四、文献综述
KRASG12C靶向药研究进展及其变构位点抑制剂综述
摘要：KRAS基因属于RAS家族，是人类癌症中常见的基因突变之一，其编码的蛋白是一种小GTP酶。突变型KRAS功能异常，持续保持与GTP结合的活化状态，导致细胞内信号传导紊乱，启动下游信号传导，细胞增殖失控而癌变[3]。KRASG12C特指KRAS的12位Gly突变为半胱氨酸(cysteine,Cys,C)，约13%的肺癌和3%的结肠癌中存在，该突变的12位甘氨酸突变为半胱氨酸后，有可能可以与小分子共价结合，因此研发与此半胱氨酸结合的变构位点抑制剂具有较好的开发前景。本文就针对国内外KRAS G12C靶向药物研究进展及其变构位点抑制剂进行综述。
关键词：KRAS靶点；分子靶向药物；变构位点抑制剂
Research progress of KRAS G12C target drugs and review of their inhibitors of allosteric sites
Abstract:The KRAS gene belongs to the Ras family and is one of the common gene mutations in human cancer. The KRAS gene encodes a small GTP enzyme. The mutant Kras continued to remain active in combination with GTP, resulting in the disorder of intracellular signal transduction, the initiation of downstream signal transduction, uncontrolled cell proliferation and carcinogenesis. KRAS G12C specifically refers to KRAS 12-Gly mutation to Cysteine (Cys, C) , which is present in about 13% of lung cancer and 3% of colon cancer, therefore, the research and development of the inhibitors of allosteric sites binding to Cysteine have a good prospect. In this review, the progress of KRAS G12C targeted drugs and the inhibitors of its allosteric sites were reviewed.
Key words:KRAStarget; molecular targeted drugs; allosteric site inhibitor
一、KRAS G12C 抑制剂的设计策略
KRAS与GTP（磷酸化的GDP）结合时，KRAS活性构象蛋白表面的Switch Ⅰ和Switch Ⅱ处于闭合状态。当KRAS与GDP 结合时，不仅失去活性而且蛋白表面出现一些结合空腔[4]。理论上，设计小分子靶向占据 GTP 结合位点，就可以使 KRAS 稳定在失活构象。但是由于 KRAS 蛋白表面非常光滑，仅有一个与 GTP 结合的位点且与其亲和力非常强，细胞中 GTP 浓度非常高，使得直接靶向 GTP 结合位点的抑制剂极难发挥作用[5]。
近年来的研究发现，在 KRAS G12C 突变体中，存在着一个能够被共价抑制剂结合的变构位点。小分子抑制剂通过与突变生成的半胱氨酸共价结合，将KRAS G12C 的构象锁定在失活状态，从而抑制其突变体的活性。
二、KRAS G12C 抑制剂研究现状
近年来，对KRAS突变体的共价抑制剂取得了较大进展，当前研究最多的KRAS G12C 变构位点抑制剂主要是通过改变 KRAS 蛋白结构或干扰其与核苷酸交换因子（如SOS蛋白）形成的蛋白-蛋白相互作用而发挥作用[6]。这些变构配体与KRAS G12C 的结合不会干扰鸟苷核苷酸底物位点，克服了 KRAS G12C 与 GTP 结合力极强的缺点[7]。
目前的变构抑制剂按结构类型大约分为氨基乙酮类、喹唑啉类、四氢吡啶并嘧啶类、吡啶并嘧啶酮类以及吲哚类。进入临床的KRAS G12C小分子抑制剂有勃林格殷格翰公司的BI-2852 、Wellspring公司的ARS-853，ARS-1620和ARS-3248、MIRATI公司的MRTX-849以及安进公司的AMG510等。其中安进公司开发的AMG510在不到一年的时间里就获得了良好的临床结果，这也是首个公布临床试验数据的 KRAS G12C 抑制剂，目前已经获得美国 FDA批准用于治疗非小细胞肺癌以及结直肠癌。
AMG510是一种不可逆的KRAS G12C共价抑制剂，其化学名称为4-［（S）-4-丙烯酰-2-甲基哌嗪-1-基］-6-氟-7-（2-氟-6-羟基苯基）-1-（2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基）吡啶（2，3-d）嘧啶-2（1H）-酮，分子式为 C30H30F2N6O3，相对分子质量为560. 59[8]，是基于2018 年 Lanman 等[9]报道的吡啶并嘧啶酮类专利化合物研发合成。AMG 510 与在 KRAS G12C 突变生成的半胱氨酸共价结合后更倾向于 GDP 的结合，导致GTP 与 KRAS 的亲和力降低，同时阻碍鸟苷酸交换因子（guanosine exchange factor，GEF）催化 GTP 替换GDP，通过将 KRAS G12C
突变体特异性的不可逆的锁定在非激活的 GDP 结合状态，从而抑制其细胞增殖活性[10]。
五、参考文献：
[1]蒋建利,付之光.抗肿瘤小分子靶向药物及靶点研究进展[J].转化医学电子杂志,2016,3(01):5-8.
[2]贾守薇,刘韬,黄红兵.分子靶向抗肿瘤药物的不良反应及其处理对策[J].肿瘤药学,2014,4(01):2-9.
[3]Araujo Luiz Henrique,Souza Bianca Mendes,Leite Laura Rabelo,Parma Sabrina A. F.,Lopes Natlia P.,Malta Frederico S. V.,Freire Mara C. M.. Molecular profile of KRASG12C-mutant colorectal and non-small-cell lung cancer[J]. BMC Cancer,2021,21(1).
[4]Nnadi C I,Jenkins M L, Gentile D R, et al.Novel KRAS G12C switch-
Ⅱ covalent binders destabilize Ras and accelerate nucleotide
exchange[J]. J Chem Inf Model, 2018, 58(2), 464-471.
[5]Mc Carthy M J, Pagba C V, Prakash P, et al. Discovery of high-affinity noncovalent allosteric KRAS inhibitors that disrupt effector binding[J].
ACS Omega, 2019, 4(2): 2921-2930.
[6]Hansen R, Peters U, Babbar A, et al. The reactivity-driven biochemical
mechanism of covalent KRAS(G12C) inhibitors[J]. Nat Struct Mol Biol,
2018, 25(6): 454-462.
[7]Lito P, Solomon M, Hansen R, et al. Allele-specific inhibitors inactivate mutant KRAS G12C by a trapping mechanism[J]. Science, 2016, 351(6273): 604-608.
[8]王灵智,于芳,何宇鹏,李行舟.针对KRAS G12C的首个抗肿瘤药物AMG 510[J].临床药物治疗杂志,2020,18(05):31-34.
[9]Lanman B A, Cee V J, Pickrell A J, et al. KRAS G12C inhibitors and methods of using the same: WO, 15/849,905[P]. 2018-6-28.
[10]Brian A L，Jennifer R A，John G A，et al. Discovery of a covalent inhibitor of KRAS G12C（AMG 510）for the treatment ofsolid tumors［J］.J Med Chem，2020，63（1）：52-65.
开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题的研究背景、意义和目的
恶性肿瘤目前仍然是全球排名第二的致死性疾病[1]，与恶性肿瘤的常规治疗方法如手术、化疗和放疗等不同，分子靶向治疗作为肿瘤治疗的新手段，正以其良好的疗效、显著的耐受性以及高度特异性等优势在临床上取得广泛的应用，目前已有多种抗肿瘤分子靶向药物在国内外上市，但同时靶向药仍存在许多毒性反应，常见分类有皮肤毒性、消化道不良反应、心血管毒性、肝毒性反应等[2]。
本次实验使用的KRAS靶点抑制药ZY-293即是一类小分子抗肿瘤靶向药物。KRAS基因属于RAS家族，是人类癌症中常见的基因突变之一，其编码的蛋白是一种小GTP酶。突变型KRAS功能异常，持续保持与GTP结合的活化状态，导致细胞内信号传导紊乱，启动下游信号传导，细胞增殖失控而癌变[3]。KRASG12C特指KRAS的12位Gly突变为半胱氨酸(cysteine,Cys,C)，约13%的肺癌和3%的结肠癌中存在该突变。本试验所用药物ZY-293通过直接靶向KRASG12C达到抑制癌症的效果。
该项研究计划采用最大给药量法进行给药，目的在于观察Beagle犬单次灌胃给予ZY-293可能出现的毒性反应及其类别，药后对临床观察、给药、体重、食量、体温、临床病理等指标进行检查与记录，并对动物进行解剖，进行大体解剖观察。实验结束之后整理总结试验数据及分析各项指标，对ZY-293进行安全性评价，判断毒性反应与该药物的相关性，初步判断可能的毒性靶器官/组织，估算临床初始量和安全范围，以及为临床急性毒性反应监测及防治提供参考。
二、实验内容
1、动物分组和给药剂量：
根据给药前（D-2）测定的动物体重，选择体重相近的动物，使用计算机系统将动物按性别区段随机分为如下4组：
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