钠通道亚型Nav1.5-HEK 293细胞系的建立文献综述

 2023-02-16 07:02

一 文献综述-Nav1.5通道研究进展离子通道是细胞形成膜电位的基本结构,通过产生动作电位或形成膜内外电位梯度,细胞之间信息得以传递。

人类遗传学研究表明,离子通道功能失调与多种疾病的发生、发展过程有密切的关系。

但是,由于手动膜片钳技术是离子通道功能测定的金标准,但其技术要求高,研究相当费时、费力,不适合药物研制早期功能性离子通道配体的发现。

而自动膜片钳技术耗材非常昂贵,且数据收集成功率不高,在国内外学术界得不到广泛采用,离子通道药物的发现进展缓慢。

本研究拟建立稳定转染的Nav1.5 HEK293细胞系,通过荧光信号快速检测读板仪FLIPR的膜电位检测,使用钠离子通道新位点的开放剂 Antillatoxin开放钠离子通道,诱导膜电位改变,进行化合物的初步筛选,可快速筛选得到Nav1.5配体,有助于发现可能作用于心脏钠离子通道的化合物。

1.1 Nav1.5通道结构Nav1.5alpha;亚基是Nav1.5通道的核心亚单位, 由2016个氨基酸残基组成, 参与构成Nav1.5Na 通道电压-门控性电活动的主体 .该亚单位主要有3 部分构成, 即4 个高度同源的跨膜结构域, 2 个长的胞内环袢和一个短的胞内环袢, N 末端和C 末端(C-T 和N-T).每个跨膜结构域均包含6 个疏水性的alpha;螺旋跨膜片段 , 与Nav1.5Na 通道的激活密切相关.此外, 此区含有的磷酸化位点可能与Nav1.5 的功能调节有关, 这也决定了S5 与S6 之间的连接袢较其它跨膜片段之间的连接袢要长.跨膜结构域D Ⅲ-D Ⅳ之间的连接袢有3 个疏水性的氨基酸残基, 即异亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸, 简称IFM 结构, 该结构可易化细胞内的信息传递, 与Nav1.5 的快速失活密切相关.1.2 Nav1.5通道的药理学特性 在药理学上, TTX 是Na通道的特异性阻滞剂,根据Na 通道对TTX 的敏感性, 将其分为两类, 一类对TTX 敏感(TTX-S), 另一类对TTX 抵抗或不敏感(TTX-R , TTX-I).多数Na 通道变构体可被nmol L 浓度的TTX 所阻断, 即TTX-S , 而Nav1.5只能被大于1 mu;mol L 浓度的TTX 所阻断, 所以被称为TTX-R , 不同Na通道变构体对TTX 敏感性不同的原因与Na 通道P 区的特异氨基酸有关.有实验发现, 改变该区的1 个氨基酸, 可能会彻底改变Na 通道对TTX 的敏感性. 1.3 Nav1.5 Nav1.5 与心脏疾病Nav1.5Na 通道是心肌的主要Na 通道, 在心肌电活动中发挥重要的作用, 许多心脏疾患已被证明是Nav1.5 SCN5A 基因突变所致, 如先天性或获得性长QT 综合症(LQTS)、Brugada 综合症、心肌传导功能障碍及婴儿猝死综合症(sudden infant deathsyndrome)等,.最近还发现, Nav1.5 SCN5A基因的一个全新的突变可以引发表型更为复杂的心肌传导功能障碍, 即心室纤颤和扩张性心肌病 .以上心肌疾病的发生可以是Nav1.5 SCN5A 基因的一个点突变, 也可以是多个点突变, 但这些基因突变的位点常发生在Nav1.5Na 通道D Ⅱ ~ D Ⅲ连接区.基因突变后编码产生具有异常电活动的Nav1.5Na 通道, 从而引发心肌传导功能障碍, 其主要机制涉及以下3 方面:1)Nav1.5Na 通道灭活延迟产生持续性Na 电流, 导致连续性动作电位放电阈值减低, 此为常见机制.2)Nav1.5Na 通道从灭活状态快速恢复,导致动作电位放电频率增加. 3)Nav1.5Na 通道在细胞膜的表达及分布发生了变化[ 11 , 16 , 28, 30] .从基因突变到产生具有异常功能的Nav1.5Na 通道蛋白需要涉及复制、转录、翻译和基因表达调控等多个方面, 所以要从基因水平上治疗由于Nav1.5Na 通道基因突变所致的心脏疾病相当困难, 但是随着基因调控技术的不断进步, 从基因水平上治疗由于Na 通道基因突变引起的心脏疾病或可能会有新的突破.二.实验设计-稳定表达Nav1.5 HEK-293细胞系的建立 2.1转染步骤⑴ 于转染前一天用D型多聚赖氨酸包被T60中皿,继而进行细胞正常消化传代,细胞铺板个数为4105 cells/dish,DMEM培养基无双抗无血清,体积5 mL,细胞汇合度50%。

⑵ 10 mu;g质粒稀释至250 mu;L DMEM中,10 mu;L Lipofectamine 2000稀释至250 mu;L DMEM中。

⑶ 将250 mu;L质粒稀释液逐滴加入250 mu;L Lipofectamine 2000稀释液中(缓慢混合均匀)。

⑷ 混合物室温孵育1 h后,将其逐滴均匀加入铺有细胞的培养皿中。

⑸ 转染24 h后吸弃混合物,加入正常培养基5 mL进行培养。

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