开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、文献综述及研究目的意义
2 型糖尿病是一种高度特异质性的代谢紊乱综合征，其基本病理是在胰岛素抵抗的基础上又合并有胰岛功能的明显减退，胰岛细胞分泌胰岛素的质和量下降。目前的治疗方案侧重于对血糖的控制，可能忽略对胰岛功能的保护。艾塞那肽(Exendin- 4)是首个获得美国食品药品管理局 (FDA) 批准的胰高血糖素样肽 -1(GLP-1) 受体激动剂，为从毒蜥唾液腺中分离到的 GLP-1 类似物，由 39 个氨基酸残基组成，分子量为 4 262.67，与 GLP-1 有 53% 的同源性，与 GLP-1 同作用于 G-蛋白偶联受体，并具有更高亲和力【1】，半衰期更长【2】。艾塞那肽能增加葡萄糖依赖性胰岛素分泌 ；减少胰高血糖素的分泌，使得肝脏输出的葡萄糖减少；减少食物的吸收，使体重减轻 ；延缓胃排空，使餐后葡萄糖升高的速率减慢，且不会增加胃酸分泌【3】。艾塞那肽可在调节血糖的同时，保护胰岛功能，并改善患者的体重增加等问题，临床应用前景良好【4】。
目前 Exendin-4 主要是通过化学合成法获得，虽然其蛋白序列较短，但生产成本昂贵，合成过程中差错率高，很难对其进行大规模的扩大生产。利用基因工程技术生产 Exendin-4 成为一个新的获得途径。已经有用大肠杆菌对其进行重组表达的报道，但表达方式多为包涵体【5】
，包涵体复性的困难依旧增加了其生产成本。也有在大肠杆菌和酵母菌中分泌表达的报道，如河南师范大学张红绪等将 Exendin-4 分泌表达到大肠杆菌周质腔中【6】，华东科技大学 Jin Zhou 等利用毕赤酵母分泌表达融合 Exendin-4【7】，但是因其产量低，纯化过程繁琐而未能大规模生产。本课题利用基因工程技术获得了 Exendin-4 高产菌株，表达的目的蛋白为可溶性，这大大降低了包涵体变性复性的繁琐过程与花费。通过基因工程生产Exendin- 4,不仅可以实现工业化的大规模生产、有效地降低生产成本,而且可以减少污染。本研究旨在研究Exendin- 4在大肠杆菌中高效表达工艺、探索简便易行的高效表达方法、为基因工程生产Exendin- 4奠定基础。
大肠杆菌发酵与制药:发酵是通过微生物的培养而获得产物的过程。发酵工程按需氧分为好氧发酵和厌氧发酵。按照产物的不同，可以分为以获得微生物菌体为目的菌体发酵；获得酶为目的的酶发酵；获得氨基酸，核苷酸，维生素等初级代谢产物和次级代谢产物抗生素为目的的代谢产物发酵；利用微生物的一种或多种酶把一种化合物转变为结构相关的更有价值的产物的生化反应为转化发酵。发酵制药就是利用制药微生物，通过发酵培养，在一定条件下，生长繁殖，同时在代谢过程中产生药物，然后，从发酵液中提取分离、纯化精制，获得药品。大肠杆菌结构简单、遗传背景清晰、生长周期短，成为最为常用的宿主菌，被广泛应用于重组药物的生产，如胰岛素【8】干扰素【9】等。基因工程技术和发酵技术结合，使得原来无法获得的许多天然蛋白能够用重组大肠杆菌大量生产。一般大肠杆菌发酵都属于液体深层培养，即是把菌种接种到发酵罐中，使菌体细胞游离悬浮在液体培养基中，并进行生长的一种培养方法。深层液体培养一般需要通入空气并进行搅拌，是传统的微生物发酵培养方法。大肠杆菌常用的发酵方式为分批发酵与分批补料发酵。分批式发酵是指把菌体和培养液一次性装入发酵罐，在最佳条件下进行发酵培养。经过一段时间，完成菌体的生长和产物的合成与积累后，将全部培养物取出，结束发酵培养。然后清洗发酵罐，装料、灭菌后再进行下一轮分批操作。其操作方法步骤接近于实验室摇瓶培养，是实验与生产衔接的重要步骤，在发酵工业中占有重要地位。分批补料发酵是指在分批式操作的基础上，连续不断补充新培养基，但不取出培养液。由于不断补充新培养基，整个发酵体积与分批式操作相比是在不断增加。这种发酵方式优点在于缩小发酵培养体积，增加蛋白质表达量，降低生产成本，提高生产率，是大肠杆菌发酵最常见的也是实际生产中最常用到的【10】。
二、研究手段
1.文献研究法：文献法的一般过程包括五个基本环节，分别是：提出课题或假设、研究设计、搜集文献、整理文献和进行文献综述。文献法的提出课题或假设是指依据现有的理论、事实和需要，对有关文献进行分析整理或重新归类研究的构思。研究设计首先要建立研究目标，研究目标是指使用可操作的定义方式，将课题或假设的内容设计成具体的、可以操作的、可以重复的文献研究活动，它能解决专门的问题和具有一定的意义。本课题围绕Exendin- 4在大肠杆菌中高效表达工艺这方面进行文献的搜索、查阅、整理。
2.实验法：实验法是通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果联系的一种科研方法。本课题属于应用课题，所得数据结论建立在实验的基础上，通过实验的方法来进行课题的研究。
3.定量及定性分析法：在科学研究中，通过定量分析法可以使人们对研究对象的认识进一步精确化，以便更加科学地揭示规律，把握本质，理清关系，预测事物的发展趋势。定性分析法就是对研究对象进行质的方面的分析。具体地说是运用归纳和演绎、分析与综合以及抽象与概括等方法，对获得的各种材料进行思维加工，从而能去粗取精、去伪存真、由此及彼、由表及里，达到认识事物本质、揭示内在规律。
