文献综述（或调研报告）：
荧光蛋白及类似物在生物探针及细胞成像等方面的研究应用进展
摘要：绿色荧光蛋白（GFP）自1962年被发现以来，由于其自身优异的光物理性质，引起了研究者们的广泛关注。作为一种基因编码的荧光标签，绿色荧光蛋白可广泛应用于生物技术中。作为生物体内提取出的荧光物质，GFP具有低毒性、生物相容性好、stokes位移大等优点。随着研究的不断深入，各种基于绿色荧光蛋白的荧光团咪唑啉酮（HDBI）的类似物被合成出来，表现出了不同的光物理性质，可作为荧光探针在分子生物等领域得到广泛的应用。
一、引言
上世纪六十年代，Osamu Shimomura在Frank Johnson教授课题组进行一种名为水螅水母(Aequorea)的独特生物发光现象。此前的研究表明，生物发光的机理主要是荧光素-荧光素酶之间作用的结果，例如海萤和萤火虫。而水螅水母则不同——通过一系列研究，两种蛋白质在水螅水母的生物荧光中被认为起到了关键作用：钙离子结合蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)，在从超过10000只水母提取出了1mg钙离子结合蛋白后，Osamu等决定将其命名为水母发光蛋白(aequorin)【1】。1962年，Osamu等人发表了关于水母发光蛋白的提取、纯化及性质研究的工作报道【1】。在这项工作中，他们发现荧光蛋白在日光下发出轻微的绿光，在钨灯下发出黄光，并且在紫外光下发出强烈的绿光，这是人们第一次认识到水螅水母的生物荧光现象是由某种蛋白质引起的。自此，荧光蛋白进入了人们的视野，2008年Osamu, M.Chalfie和R.Tsien因在绿色荧光蛋白领域的研究贡献而获得诺贝尔化学奖。
二、绿色荧光蛋白生色团
Osamu Shimomura在GFP方面的研究中，最为重要的贡献在于确证了GFP荧光团的化学结构。他先将绿色荧光蛋白变性，并使用木瓜蛋白酶处理，最终得到一种吸收波长在300nm以上并且吸收光谱与GFP类似的物质。通过紫外可见光谱、质谱等方法，Shimomura最终确定了如图1所示的结构【2】。尽管当时该物质并不具有荧光特性，但仍旧被认为是GFP的荧光团。1994年，M. Chalfie 等人将GFP分别在大肠杆菌和秀丽隐杆线虫细胞中表达，发现大肠杆菌表达出的GFP与直接从水母中提取的GFP具有相同的荧光发射和激发光谱，从而可得出结论，GFP的荧光并不需要水螅水母中产生的其他物质作用，因此GFP的表达可以用来在活体中监测基因表达以及进行蛋白质的定位【3】。
直到1996年，GFP的晶体结构才被解析出来。如图2所示，GFP由11缕beta;折叠构成外周的桶状结构，alpha;螺旋贯穿其中，桶的直径为24 A˚ ，高为42 A˚ 。荧光团位于桶的中央位置，该荧光团与外部的溶剂分子形成氢键。GFP的晶体结构表明，若干个极性氨基酸残基和溶剂中的水分子参与形成了荧光团周围的氢键网络结构，图3展示了S66TGFP中荧光团和周围蛋白质间存在的各种短程力【4】。
荧光蛋白作为生物体内的天然荧光性物质，由于其独特的光物理性质，在荧光探针、生物成像、临床诊断等领域具有广泛的研究和应用前景。天然存在的GFP荧光团发射绿光，基于对荧光蛋白荧光团的研究，除红色外，绿色、青色、蓝色、黄色荧光蛋白在上世纪九十年代末都已经成功合成出来。为了得到红色荧光蛋白，研究者们纷纷尝试将GFP进行变异以得到红色荧光的GFP变体，但并未得到令人满意的结果。直到1999年，Lukyanov及其同事在红色荧光蛋白方面取得了突破性进展【6】。他们创造性地提出，GFP并非总与生物荧光具有密切联系，在进化过程中各功能域相互联系整合，在系统发育中生物发光相对独立地进化，也就是说GFP与水母发光蛋白在进化过程中是相对独立的，并且荧光蛋白与其他生物发光物质并没有所设想的紧密联系。基于这种假设，他们将目光移向珊瑚，这种具有红色荧光但并非生物荧光的现象对应了他们的假设。从珊瑚礁中分离出了与GFP同源的几种荧光蛋白后，发现其中两种与GFP具有完全不同的光谱，并非发射绿光而是红色和黄色荧光。Lukyanov等人的研究在为荧光蛋白方面开启了新的思路，即将注意力更多放在荧光蛋白的分子机制本身而非致力于利用生物技术提取或变异已有的蛋白。
最早被确定结构的绿GFP荧光团为5-（4-羟基亚苄基）-2,3-二甲基-3,5-二氢-4H-咪唑-4-酮（p-HBDI）。由于独立存在于溶液中的荧光团很容易发生光异构化，从而迅速内转换至基态【7】，因此是不具有荧光特性的。然而，在GFP的beta;-桶状结构中，由于来自各个方向的共价键和氢键作用使得荧光团在结构上被锁定，使得荧光团在激发态下只能通过辐射跃迁途径释放能量，从而发射荧光【8】。GFP的荧光是基于激发态质子转移（ESPT）机制，p-HBDI中苯环上的羟基作为质子供体【9】，通过质子传递过程，质子迁移至E222残基，通过ESPT过程形成的阴离子激发态被认为是GFP发射绿光的原因【10】。
