内生真菌对盐碱胁迫下种子萌发及苗期生长的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义：

内生真菌是指生活在植物体内部，而并不使其表现出病症的一类特殊的微生物^[1]。禾本科植物内生真菌的宿主品种繁多，分布非常广泛，并且部分种类具有较高的宿主特异性^[2]。

对内生菌共生时盐碱胁迫下禾本科植物种子萌发和苗期生长的研究，有利于研究内生菌共生下植物的生长特性和发育特点，从而进一步归纳和探索内生菌共生植物的种子萌发和苗期生长特点及其影响因素，以利育种和作物改良。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

（1） 调查内生真菌对盐碱胁迫下禾草种子萌发的影响

（2） 调查内生真菌对盐碱胁迫下禾草苗期生长的影响

3. 研究的方法与方案

研究方法：

一．水培法种子萌发

二．计数法记录种子萌发数据

三．土培法幼苗生长

四．超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定：

1．酶液制备

2.酶活性测定

按下表加入试剂:

在560nm处测定反应液的光密度

3.蛋白含量的测定

考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量

SOD比活力=SOD总活性/蛋白质总浓度

五．过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶（CAT）活性的测定

1. 酶液的制备

2. CAT 活性的测定

在3ml的反应体系中，包括0.3% H2 02 1ml, H2 0 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液

启动反应，测定波长240nm处的OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。

3. POD 活性的测定

在3ml的反应体系中，包括0.3% H2 02 1ml, .0.2% 愈创木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，最后加入0.05ml酶液启动反应，记录470nm处OD增加速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。4. 用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量.

六．丙二醛（MDA）含量的测定

1. 丙二醛的提取

2. 显色反应及测定

分别在532、600和450nm波长下测定吸光度

3.计算丙二醛含量

七．数据统计

用SPSS和GraphPad Prism 5进行数据处理

技术路线：(见附件）

实验方案及可行性分析：

1. 实验材料准备

选取饱满均匀的含菌鹅观草种子，及不含菌种子消毒处理（75%酒精 3min，1%次氯酸钠 2min，75%酒精3min，蒸馏水洗涤）后，置于培养皿中。

设置盐浓度梯度：0（CK）NaCl，5mg/ml NaCl，10mg/ml NaCl，15mg/ml NaCl，20mg/ml NaCl；碱浓度梯度：0（CK）Na₂CO₃，5mg/ml Na₂CO₃，10mg/ml Na₂CO₃，15mg/ml Na₂CO₃，20mg/ml Na₂CO₃。每个浓度梯度设置3个重复。

将消毒后的种子1/3做盐碱处理，剩余2/3不做处理，放温室中培育备用。

2. 检测种子发芽指数

每天观察盐碱处理种子的发芽情况，记录发芽数，10天后统计发芽率、萌发速度和发芽整齐程度。

3. 处理苗期植株

将温室中培育10天后萌发初期的苗株移植至盆钵中，选取其中一半植株每日用盐碱溶液喷淋处理，每个浓度梯度设置3个重复，温室培育。剩余一半温室培育备用。

4. 检测萌发初期植株生理指标

将盐碱处理10天后的萌发初期苗株，检测其株高、叶片大小，叶片含水量、蛋白质含量、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，以及丙二醛（MDA）含量等生理指标。

5. 处理分蘖期植株

将温室培育至分蘖期（3-4分蘖）的植株，每日用盐碱溶液喷淋处理，每个浓度梯度设置3个重复，温室培育。

6. 检测分蘖期植株生理指标

将盐碱处理10天后的分蘖期苗株，检测其株高、叶片大小，叶片含水量、蛋白质含量、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，以及丙二醛（MDA）含量等生理指标。

经过查阅相关文献，及对所需仪器、用品等条件综合评估后，认为该实验方案可行。

4. 研究创新点

目前，国内外对于禾本科内生真菌的各项生理生化特点及其对宿主植物各项生理生化特性的影响与互作，已经开展了较多的研究，包括形态学特征、遗传多样性、抗旱、抗病、抗虫害、重金属胁迫等。但关于盐碱胁迫的探索相对非常匮乏，是一个较新的研究方向。

5. 研究计划与进展

2018年3月上旬，撰写开题报告，开始材料准备；

2018年3月中下旬，进行种子萌发期处理及相关指标检测；

2018年4月上旬，进行苗期培育及处理；