1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪链球菌（streptococcus suis）是猪的重要致病菌，根据荚膜多糖抗原的不同，分为33个血清型和较多未定型菌株。其中，猪链球菌2型致病力最强，流行最广，临床上主要引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎等，甚至可以导致急性死亡[1,2]。1968年，丹麦首次报道猪链球菌感染人致死事件[3]。我国曾在1998年和2005年，两次爆发2型猪链球菌感染人的公共卫生事件，导致生猪从业人员死亡。在香港和越南，猪链球菌是引起人细菌性脑膜炎的主要病原[4,5]。
猪链球菌可精细调控毒力基因表达。传统的转录调控因子主要为蛋白质类。据报道，目前至少有16种转录调控因子参与调控基因的表达，影响猪链球菌在宿主体内增殖感染[6]。如转录因子ciar-ciah，参与调控黏附相关蛋白，影响猪链球菌对宿主细胞的黏附[7]；毒力负调控因子covr负调控荚膜合成相关基因、表面蛋白、溶血素的表达，使荚膜变薄，溶血活性降低，影响细菌毒力[8]。此外，猪链球菌小rna（small rna, srna）也参与对毒力的调控[9]。细菌srnas大多数长度小于500nt，在细菌基因组中转录但不翻译[9]。srnas通常位于基因间隔区，与位于其他位置的靶位mrna通过碱基配对有限互补结合。结合靶位可位于核糖体结合位点（rbs）附近或远离rbs，直接或间接影响核糖体与mrna的结合从而影响翻译，或者影响mrna的稳定性[10]。
本课题组前期研究发现猪链球菌29个位于基因间隔区的srnas，其中srna rss06等5个srnas缺失株对斑马鱼毒力显著降低，说明这5个srnas与猪链球菌的毒力有关[9]。rss06在猪血液中上调表达，与野生株相比，rss06缺失株在猪血中存活能力显著降低[9]，但rss06的直接靶位及调控毒力的机制未知。
2. 研究的基本内容和问题
1 研究目标
1.1 构建pset4s-同源臂-强启动子-ssu0057-flag等4个重组质粒。
1.2 通过western blot，验证预测的rss06直接结合靶位。
3. 研究的方法与方案
1 研究方法 1.1 构建pSET4S-同源臂-强启动子-SSU0057-Flag等4个重组质粒 1.1.1引物设计设计同源臂的上下游引物PU和PD，PU 5端添加EcoRI酶切位点；设计强启动子上下游引物promoter-A和promoter-B，promoter-A引物5端添加引物PD的反向互补序列；设计4对特异性引物分别扩增SSU0057等4个靶位基因的5UTR与ORF区域，上游特异性引物5端添加promoter-B反向互补序列，下游特异性引物5端均添加2个Flag标签及BamHI酶切位点。 1.1.2 融合PCR用引物PU、PD和promoter-A和promoter-B分别扩增同源臂与强启动子片段，回收PCR产物，然后以回收产物为模板，使用引物PU和promoter-B扩增同源臂与强启动子融合片段，回收PCR产物。特异性引物分别扩增SSU0057等4个靶位基因，回收PCR产物。以靶位基因片段和同源臂强启动子融合片段为模板，使用PU及下游特异性引物扩增同源臂-强启动子-靶位基因-Flag融合片段，回收PCR产物。 1.1.3 构建重组质粒以限制性内切酶EcoRI与BamHI酶切融合PCR产物和质粒pSET4S，胶回收酶切后的pSET4S和融合片段，在T4 DNA连接酶的作用下16℃连接30min。 1.1.4 化学转化重组质粒取8-10μL质粒缓慢转着加到感受态中，冰浴30min。42℃热激30min，冰浴2-3min。取出后加800μL LB液体培养基，置于37℃摇床1h。4000rpm离心4min，弃800μL上清，重悬菌体，100μL菌液涂LS平板，37℃倒置过夜。 1.1.5 鉴定重组质粒每份样品挑取20个单菌过夜扩大培养，pSET4S通用引物4s-F和4s-R进行PCR鉴定，挑取2个阳性克隆提取质粒并进行酶切和测序，验证正确后进行下一步实验。 1.2电转并整合重组质粒至P1/7和Δrss06基因组 1.2.1猪链球菌P1/7感受态和Δrss06感受态的制备将P1/7和Δrss06在THB血平板上划线分离，37 C温箱中倒置培养过夜。从血平板上挑取单菌落接种到5mL THB液体培养基中，37 C过夜培养。以1:100比例接菌，1:50加血清，转接到新鲜含40mM DL-苏氨酸的THY液体培养基中培养至对数早期（OD600=0.4-0.5），冰浴40 min。4 C 8000 rpm离心10 min，收集菌体，用30mL预冷的EB重悬细胞，4C 8000rpm离心10min，洗涤两次。用15%甘油重悬细胞，4C 8000rpm离心10min，洗涤两次。最后以15%甘油将菌体重悬，以80μL分装至预冷的EP管中，-80C保存备用。 1.2.2 电转化P1/7和Δrss06分别取8mL pSET4S-同源臂-强启动子-SSU0057-Flag等4个重组质粒，缓慢旋转加入到80mL P1/7感受态细胞和Δrss06感受态细胞中，轻轻混匀，然后转移至预冷的电击杯中，冰浴30min，设置电穿孔仪的参数为23 KV/cm2，4.9-5.0s，将电击杯外面的水擦拭干净后进行电击。电击结束后，立即向电击杯中加入900mL 28℃预热的复苏液（含0.3M蔗糖THY培养基）重悬细菌，再将细菌悬浮液转移至于5mL的复苏液中，28℃180 rpm培养3h后加入壮观霉素（Spc）至终浓度100mg/mL，28℃180rpm继续培养24-48h。 | |||
1.2.3 含重组质粒的P1/7和Δrss06筛选与鉴定将电转化重组质粒的猪链球菌P1/7和Δrss06涂THB（Spc ）平板，28℃培养24-48h，挑取单菌落PCR鉴定。 1.2.4 目的片段同源重组至细菌基因组28℃传一代后，将电转化阳性菌株转接于37℃THB（SPC ）液体培养基中培养，以进行同源重组。 1.3 通过Western Blot测定靶位基因融合蛋白表达量，验证rss06靶位 将细菌培养至OD600nm =1，用上样缓冲液稀释至0.01 OD/mL 。取5mL蛋白样品经15% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜。一抗用鼠抗Flag单克隆抗体（1:3000稀释），二抗羊抗鼠IgG（稀释度1:5000）；内参抗体为Goel兔抗多克隆抗体，二抗羊抗兔IgG（稀释度1:5000）。显色采用Tanon High-sig ECL Western Blotting Substrate，通过CCD图像采集器（Tanon 5100）捕捉化学发光信号。采用ImageJ进行灰度分析，比较靶位基因融合蛋白在P1/7和Δrss06中的表达差异。 2 技术路线 | |||
3 可行性分析 3.1 导师课题组前期已经发现猪链球菌sRNA rss06在猪血液与脑脊液中上调表达，缺失后细菌毒力降低。本试验进一步筛选并验证rss06直接作用的靶位基因，为揭示rss06调控猪链球菌毒力的分子机制奠定基础。 3.2 所在实验室属于世界动物卫生组织（OIE）猪链球菌病诊断国际参考实验室、农业部动物细菌学实验室，长期从事猪链球菌病研究，在猪链球菌防控及致病机制等方面已积累丰富经验。 |
4. 研究创新点
1. 目前对猪链球菌毒力的研究集中于蛋白质和细菌表面成分等传统的毒力因子，而深入研究sRNAs调控猪链球菌毒力的较少。
2. 通过MS2识别序列标签纯化和生物信息学等综合方法预测rss06直接靶位，为深入阐明rss06调控机制提供技术支持。
5. 研究计划与进展
1 研究计划
2016年10月-2016年11月：构建pset4s-同源臂-强启动子-ssu0057-flag等4个重组质粒；
2016年11月-2016年12月：通过western blot确定靶位基因融合蛋白表达量的差异。
