超声波法提取灵芝多糖的研究开题报告

灵芝(Ganodermalucidum)是担子菌纲、多孔菌目、灵芝科、灵芝属真菌，在我国自古就有着“仙草”的美誉。《本草纲目》中记载，灵芝“甘温无毒，主治耳聋，利关节，保神，益精气，坚筋骨，好颜色，疗虚劳，治痔”。灵芝多糖是灵芝中研究最深入最广泛的一类活性物质，它主要由D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等单糖组成，单糖之间，主链以β-(1→3)、β-(1→4)糖苷键连接，支链以β-(1→6)糖苷键连接。研究表明，灵芝多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖、降血脂等多种生物活性，因而灵芝多糖成为目前灵芝产业研究的一个热点。通过改造灵芝菌种和优化培养基可以提高灵芝多糖的产量，而优化提取方案可以提高多糖的提取效率，保证灵芝胞内多糖被尽量完全的提取出来。灵芝多糖提取的方法很多，常用的传统提取方法有：热水提取法、碱提取法、酸提取法等。目前，研究较多的新型方法，如酶解法、超声波法、微波法等，虽然具有省时、节约溶剂、提取效率较高的特点。

超声波频率是高于20kHz的机械波，超声波提取多糖是利用其在媒质中传播时可产生空化现象，空化中产生的极大压力造成被破碎物在瞬间破碎，同时，超声波产生的振动作用加强了被破碎物的扩散及溶解。采用超声提取技术用于有效成分提取，具有简便快速、高效节能、重复性好、不影响提取物的活性等许多传统方法无法比拟的优点。超声波提取法在提取生物有效成分的应用中越来越普遍，被广泛用来提取多糖、黄酮、生物碱类物质、多酚类物质、油脂类物质及有机酸类物质等。例如，王晓军、高宁、王斌等利用超声波法优化提取番茄红素；孙秀兰、张银志利用超声波法提取大米中黄曲霉毒素B1。

灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，灵芝多糖具有抗氧化和抑菌等活性。医学研究表明，自由基是细胞衰老的主要诱因，它们所造成的损害包括干扰和控制蛋白质的合成，遗传损伤，以及加速机体的衰老，而灵芝多糖能够有效地减少自由基对人体的氧化损伤，并且能够有效地保护人体必需的自由基和降低许多疾病如心脏病，癌症，关节炎，灵芝在治疗肝、肾病、高血脂、神经衰弱、心血管疾病以及肿瘤等方面都有良好的临床疗效。常用的抗氧化测定方法包括清除DPPH自由基能力的测定、总还原能力的测定、对Fe² 离子螯合能力的测定及超氧自由基（O₂^-）清除率的测定等。其次，灵芝多糖还具有抑菌活性，通过抑菌活性试验可以用来测定灵芝多糖的最低抑菌浓度，从而评价其抑菌性能。常用的测定抑菌活性的方法有滤纸片、打孔法、明碟杯法等。在接有供试菌种的固体培养基上加入少量具有抑菌性能的物质，当该物质接触培养基并且供试菌在培养过程中开始生长。有抑菌性能的物质呈球面扩散，在该物质周围会产生透明带。抑菌性能越强，在其周围产生的透明带范围越大，相反地，抑菌性能越弱，透明带范围越小。这圈透明带就称为“抑菌圈”，根据有无抑菌圈可以判断所测试的物质是否具有抑菌性能，也能根据抑菌圈大小判断物质抑菌性能的强弱。因此，灵芝多糖生理活性方面的研究是目前科研工作者的研究热点。

本论文拟运用单因素试验和正交法对超声波法提取灵芝多糖的影响因素和水平进行优化，并测定提取得到的灵芝多糖提取物的抗氧化活性和抑菌活性。

1、灵芝的预处理

灵芝干品掰成小块后用粉碎机打粉，之后用60目筛网过筛，将过筛的灵芝干粉装入250ml锥形瓶，以干粉:石油醚（1：8）比例除脂，置入40℃水浴摇床过夜后放入烘箱烘干装入干燥容器备用。

2、单因素试验

利用单因素试验分析超声波功率（40%、60%、70%、80%、100%）、超声波时间（10min、20min、30min、40min、50min）、料液比（1:15、1:20、1:25、1:30、1:35）、水浴温度（50℃、60℃、70℃、80℃、90℃）、水浴时间（30min、60min、90min、120min、150min）、pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）等因素对灵芝多糖得率的影响；用苯酚硫酸法测总糖，DNS法测还原糖；

3、正交试验

利用正交试验确定最佳的灵芝多糖提取方法（用Excel和SPSS Stattistics做数据分析）。正交试验是一种对多因素多水平试验设计进行优化的统计学方法，根据正交性从全面试验中选择部分有代表性的点进行试验，这些点具有“均匀分散、齐整可比”的特点，是一种高效、快速、经济的试验设计方法。

4、多糖精制

通过浓缩、脱蛋白（Sevage试剂）、脱色（提取液PH调至8.8，80%双氧水50℃，4h）、醇沉（80%乙醇，过夜）、复溶等步骤精制多糖；

5、抗氧化活性试验

抗氧化是灵芝的主要药效之一，抗氧化是为了防止自由基产生。利用超声波提取法得到灵芝粗多糖还原能力的测定，以及不同方法处理的羟自由基、DPPH自由基清除能力的比较，验证超声波法提取的灵芝多糖具有很好的抗氧化能力。

羟基自由基的清除：羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，它能很容易的氧化各种生物大分子，氧化效率高，能够降解DNA、细胞膜和多糖化合物，继而又发现许多由它所致有害效应，当加入羟自由基的清除剂后会明显降低。

DPPH自由基的清除：DDPH是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，有单电子，其甲醇溶液呈紫红色，并在波长517nm处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供1个电子与DPPH的孤对电子配对而使其褪色，褪色程度与其接受的电子数有关，在波长517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强、吸光度越小。

6、抑菌活性试验

采用牛津杯法、滤纸片法、打孔法等检测灵芝多糖对细菌和真菌的抑菌活性。利用滤纸片法进行细菌和真菌抑菌试验时，观察作为阳性对照的龙胆紫溶液、浓缩的灵芝多糖提取液以及作为阴性对照的无菌水是否出现抑菌圈。

牛津杯法是无菌操作下在培养基表面直接垂直放上牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入待检样品，勿使其外溢。加满后置恒温培养箱中一段时间后观察结果，抑菌圈用尺直接量就可以。牛津杯法进行抑菌试验时，控制检测平板中的菌悬液浓度十分重要，浓度过高则抑菌不效果明显，过低则菌体生长稀疏。

滤纸片法与牛津杯法原理相同，都是根据待测物在培养基表面扩散，形成透明的抑菌圈现象来判断抑菌效果。具体方法为：将打孔器打好的小圆滤纸片浸泡在待检验样品中，晾干后平铺平板上，置于恒温箱中培养。以滤纸片周围产生的抑菌圈大小作为抑菌效果的评判标准。滤纸片法简单较易操作，是实验室常采用的一种实验方法。

打孔法也是一种常采用的抑菌试验操作方法。待液体培养基倒平板冷却凝固之后，用打孔器在培养基表面打出直径为5mm的孔。除去孔内固体培养基后，用微量移液器吸取适量待测液体加入孔内，以不溢出孔的边缘为界。打孔法抑菌试验的操作方法简单易行，并且实验结果易于观察，具有快速、准确的特点。