1. 研究目的与意义
（1）绿色荧光蛋白（gfp），分子质量约为28kda，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(ser-tyr-gly)形成发光团，经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激发产生荧光，是主要发光的位置。绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，发光的基团位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一个装有色素的油漆桶。其发光团的形成不具有物种专一性，发出的荧光稳定，且不需要依赖其他基质而发光。
（2）增强型绿色荧光蛋白：目前应用较多的是gfp的突变体增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，简称egfp）。egfp将gfp的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光强度比gfp大6倍以上。所以，egfp比gfp更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等。
（3）研究增强型绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过iptg诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。再通过蛋白纯化系统，纯化出目的蛋白，根据定量分析可以计算出所纯化的目的蛋白回收率
2. 课题关键问题和重难点
1、质粒转化后要进行pcr验证是否转化成功；
2、要优化iptg诱导蛋白表达的条件；
3、确定目的蛋白是否表达及目的蛋白表达的类型；
3. 国内外研究现状（文献综述）
1：绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白(g弛en nuo弛8centpmtein， gfp)是由日本学者下村修于1962年从多管母(aegwr∞a妇r如)中发现并分离得到的一种发光蛋白。分子质量为26 ku，是由238个氨基酸构成的b一桶型三维立体结构，其中第65～67位氨基酸(丝氨酸一酪氨酸-甘氨酸)形成发光团，为主要发光的位置。gfp的结构赋予了其一些独特的性质-：荧光稳定、检测方便、无种属特异性、不需任何反应底物和辅助因子、易于构建载体，并且它不会破坏细胞生长环境，对细胞生理功能无影响等，因此是常用的报告基因。目前，科研人员根据不同需要，利用氨基酸序列修饰等方法对cfp进行改进，获得了一系列优良的变异体，发光的强度和颜色都有变化，如苯丙氨酸被亮氨酸取代，丝氨酸65被苏氨酸取代的egfp荧光强度就增加了35倍。而且出现了红色、黄绿色、蓝色等多种颜色的荧光蛋白，大大拓宽了gfp研究的领域1。近些年。国内外掀起了关于gfp研究的热潮，已见gfp应用于各人源细胞、动物细胞、植物细胞、真菌等领域中41。本研究以原核生物e．cdb此1为表达宿主，利用pcr技术从模板egfpn3中克隆得到egfp片段，并在其2端引人酶切位点踟r i和历ndⅢ，对引人酶切位点的egfp片段和pet28a质粒进行双酶切处理，连接后得到重组质粒p啪8a-egfp井转化至e．∞bl2l中，通过i盯c诱导可以高效表达。食品安全问题一直是困扰各国的公共卫生问题。食源性病原菌又是引起食品安全问题的主要因素之一。通过本研究，期望能够为以后egfp作为荧光标记物标记食源性病原菌，跟踪监测病原菌的侵染路径提供理论基础，从而为食品安全风险评估等提供合理依据。
2.增强型绿色荧光蛋白
4. 研究方案
第一步：感受态细胞制备 ；
第二步： 质粒转化；
第三步：单个菌落形成及验证；
5. 工作计划
第1-2周 依据选题的具体内容，进入实验室开始做实验，进行感受态细胞的制备及质粒转化。
第3-5周 单克隆扩大培养，确定优化诱导条件及目的单表是否有表达，确定优化超声破碎条件及目的蛋白类型(可溶或包涵体)
第5-6周 进行期中检查。
