开题报告内容：
一、课题背景
1. 肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)是肿瘤细胞生活的特殊环境，由肿瘤间质、邻近的各种组织细胞、微血管、多种免疫细胞和免疫分子组成［1］。肿瘤微环境与肿瘤的发生发展、侵袭转移有密切关系，而且在以干扰肿瘤微环境为基础的过继细胞免疫治疗中发挥了重要作用[2]。肿瘤组织微环境呈弱酸性（pH值为6.5～7.2），而肿瘤细胞内的内涵体和溶酶体具有更强的酸性（pH值为4～6）。当装载药物的适配体被内吞进肿瘤细胞的溶酶体时，溶酶体的酸性环境能引起适配体结构的变化，导致装载在适配体内的多柔比星的快速释放，进而杀灭肿瘤细胞[3]。
2. 核酸适配体是适配体是单链RNA或DNA，具有独特的3D折叠帽，能以高亲和力特异性结合各种分子靶。适配体基于核酸文库通过SELEX技术随机合成。与肽和其他小化学分子相比，适配体可以在纳摩尔范围内以非常低的解离常数结合其靶标[4]。另一方面，较之常用的抗体等靶头向性配体，适配体体积相对较小、免疫原性较低且易于体外筛选。
3. 目前，适配体靶向肿瘤的纳米递送系统通常分为三类：第1类是将适配体修饰到可装载药物的纳米载体表面，形成适配体靶向纳米载体；第2类是直接将适配体与药物/荧光物质相连，形成适配体-药物/荧光物质共轭物；第3类适配体自身作为药物载体，形成适配体-药物组装物[5]。这三类都通过适配体对肿瘤标志物的靶向作用靶向肿瘤组织部位，对肿瘤进行相关诊断或治疗。
4. 透明质酸（Hyaluronic acid，HA）在体内广泛存在，是一种呈线性带负电的糖胺聚糖，由重复的双塘单位葡萄醛酸与N-乙酰葡萄糖胺通过beta;-1,3或beta;-1，4 糖苷键连接而成[6]。透明质酸结构中含有大量羧基和羟基，对强酸、强碱、透明质酸酶(hyaluronidase, Hyal)不稳定，通过化学修饰得到性质优良的透明质酸衍生物，可用作药物、基因等物质递送的载体[7]。鉴于勃弹性和生物相容性,其可以作为一种载体与其他药物反应形成缀合物[8]。这一结合物具有控释和靶向作用,能将多种药物导向输送到各病理部位,从而达到定时、定向释放的目的[9],透明质酸本身的特点使得其在抗癌药的靶向给药方面得到较多的应用。
4. 透明质酸酶（Hyaluronidase，HAase）是广泛分布于自然界中的一类糖苷酶，通过作用于 beta;-1，3或 beta;-1，4 糖苷键来降解透明质酸[11]。许多肿瘤组织能够分泌透明质酸酶。由于HAase浓度的升高总是与肿瘤生长相关，因此在肿瘤部位中发现的HAase浓度通常比正常组织中的更高。事实上，肿瘤组织中HAase的浓度比正常组织高20-1000倍[12]。
- 要解决的问题
作为小分子核酸，核酸适配体的某些理化性质，如易被核酸酶降解、分子量小易被肾脏过滤清除等，也使其临床应用受到一定限制[13]。
- 可行性分析
- 所选用的核酸适配体：AS1411是一条含有26碱基的单链DNA适配体，序列为5rsquo;-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3rsquo;，能高亲和力特异性结合细胞膜表面的核仁素，经核仁素介导转运入胞[7]。或是在核仁素的调节和AS1411的刺激双重作用下，使癌症细胞产生巨胞引现象从而将AS1411内吞[14]。AS1411序列中有许多鸟嘌呤，而大量重复的G序列会自发形成四链体，富G寡核苷酸可通过4个鸟嘌呤间的环形hoogsteen氢键，形成一个四面体平面，并以此面为基本单位经过复杂的拓扑结构层层堆积，最终形成四链体的三维结构[15]。
- 适配体物理包埋阿霉素的优点:将化疗药嵌入核酸适配体是一种简单有效的主动靶向递药方式。这种嵌入条件通常是温和的，且不需要对药物或适配体进行任何化学修饰，药物和适配体都能保持生物活性且能达到高的载药量[16]，这种结合方式中的适配体既是主动靶向配体又是药物载体。
- 透明质酸纳米粒具有高的载药量,而且可以通过控制纳米粒的结构来控制载药量由于纳米粒和药物之间的相互作用是非共价的疏水作用,载药纳米粒被细胞内化以后药物容易释放[17]。
- 本课题设计一种透明质酸包裹装载Dox的适配体形成多级靶向纳米粒，其能响应肿瘤间质高浓度的透明质酸酶，从而裸露出适配体。适配体能与细胞膜表面的受体特异性结合，进入胞内。然后由于胞内酸性的环境，适配体结构发生改变，释放出Dox,进而杀死肿瘤细胞。
- 研究方法和内容
- 通过荧光分析法，分析测定适配体是否已成功包裹阿霉素。
- 参考相关文献，摸索多种处方，最终根据要求合成所需要的载体，即透明质酸包裹适配体载阿霉素，形成粒径合适的纳米载体，并通过马尔文粒径仪和透射电镜观察载体的形态和粒径大小。
- 测定载体的包封率。
- 考察载体的释药行为。
- 工作计划
2月28日—3月9日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。
3月9日—5月10日：完成相关实验，验证载体可行性。
