开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1.研究背景
随着基因技术的不断发展，RNA干扰已经成为分子生物学领域里的一个研究热点。RNA干扰（RNA interference， RNAi）是指双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子通过细胞内源产生或外源导入的方式进入细胞后，诱导细胞内与其同源的信使RNA（message RNA， mRNA）被降解，从而导致细胞中相应基因表达下调的现象[1]。利用RNA干扰（RNAi）可使哺乳动物基因沉默，从而可研究治疗各种疾病。在RNA干扰过程中，siRNA起着十分重要的作用。但siRNA的药理性能很低，如血清稳定性低、脱靶、先天免疫反应，为临床治疗提出了一个挑战[2]。
siRNA是一种双链RNA分子，每条链中通常含有21-23个核苷酸。在细胞质中，RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）使得siRNA的正义链被降解，并且剩余的反义链与RISC结合，从而触发mRNA的降解。siRNA理论上可以被用来抑制多种靶基因，其治疗范围涵盖从病毒感染到遗传性疾病和癌症的各种疾病[3]。由于siRNA携带负电荷和具有亲水性质[4]，siRNA递送到体内靶部位会面临一系列的障碍，所以越来越多的人关注于有效载体的开发。细胞外障碍包括：siRNA容易被各种酶降解，肾清除及RES系统（网状内皮系统）摄取和血管屏障。细胞及细胞内障碍包括：（1）能够被靶细胞摄取；（2）可以从内涵体逃逸；（3）siRNA能在细胞质中释放，形成RNA诱导的沉默复合体。（图1）
克服细胞内外障碍的策略如下：通常需要采用具有抗非特异性蛋白吸附性能的亲水性聚合物对递送系统进行亲水修饰，制备长循环siRNA药物递送体系。目前，常用的修饰分子是无免疫原性的聚乙二醇（Polyethylene glycol， PEG）及其衍生物。聚乙二醇（PEG）修饰LNP（脂质纳米颗粒）广泛用于抑制与血流中血清成分的非特异性相互作用。然而，LNP表面的聚乙二醇化也强烈抑制了LNP与内体膜的融合，妨碍了siRNA的递送，该过程被称为“PEG困境” [5]。此外，阳离子磷脂如DOTMA（N-（1-（2，3-二油酰氧基）丙基）-N，N，N-三甲基铵）或DOTAP（1，2-二油基-3-三甲基胺丙烷）通常是阳离子脂质组成中的关键部分。它们的正电荷为与细胞带负电的表面结合提供了静电相互作用。“辅助”脂质如DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺），其促融合性质在siRNA -脂质复合物被细胞内化后有利于内涵体逃逸[6]。而定点释放策略主要有两种:外源性刺激响应性释放和内源性刺激响应性释放。外源性刺激响应性释放是载体感知外界环境的变化，如温度、光照、磁场和超声等，发生自身结构变化，从而改变药物释放和生物学分布等行为。内源性刺激响应性释放是载体感知疾病环境与正常组织的不同，如缺氧、低pH、特定酶含量增加等，发生结构变化，实现触发性释药 [7]。Guojun Chen等人开发了一种独特的pH-氧化还原双敏感阳离子单分子纳米粒子，其阳离子核心包含由于细胞内存在高浓度还原型谷胱甘肽（GSH）而发生细胞内还原的可还原的二硫键，从而促进siRNA的释放[8]。
图1递送siRNA的胞外（A）和胞内（B）障碍示意图[3]
目前对 siRNA的递送方式主要有两类形式：一种是对siRNA进行化学修饰后递送，二是通过载体递送。siRNA递送载体分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有安全性和靶向性等问题。本文主要研究递送siRNA的非病毒载体，与病毒载体相比，非病毒载体由于具有易于合成修饰、低免疫反应和靶向性强等优势，在siRNA药物递送治疗中具有广泛的应用。目前，常用的非病毒载体主要包括阳离子脂质体（Cationic liposomes）、聚合物（Polymers）、树枝状大分子（Dendrimers）以及无机纳米载体（Inorganic nanopartics）等[9]。脂质体由于具有良好的生物相容性，体内长循环和在肿瘤部位富集等特性越来越受到重视[10]。其中，阳离子脂质体具有良好的应用前景。阳离子脂质体可以由两亲性阳离子脂质制备而成，其优点是可以进行靶向修饰，具有较低的免疫原性及毒性，血液循环中溶解性较好，制备简单和易于规模化生产等。因此，本课题组在此前合成了一系列以叔胺基团为头基的阳离子脂质，现旨在对该阳离子脂质库进行递送siRNA的细胞筛选，以寻找一种更高效更安全的阳离子脂质体。
2.研究内容和方法
阳离子脂质由阳离子亲水性头部、连接臂和疏水尾部三部分组成[11]。我们采用叔胺基团作为阳离子头部，机理如下：（1）在酸性pH条件下，阳离子脂质分子的叔胺基团可以质子化形成季铵基团，形成的季铵基团压缩带有负电荷的siRNA药物分子，形成稳定的核酸-脂质粒子（Stabilized nucleic acid lipid particles，SNALPs）。（2）循环系统pH为中性，亲水端季铵基团去质子化后SNALPs表现为电中性或低的正电性，减弱了与血液中负电荷蛋白质的非特异性吸附，从而延长了siRNA药物体系的循环半衰期。（3）SNALPs进入细胞后，内涵体中的酸性条件诱导阳离子脂质的叔胺基团再次发生质子化，从而有利于siRNA药物逃离内涵体进入细胞质发挥基因下调作用[12]。
