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论文的背景、目的和意义 |
单基因遗传病是由基因突变所引起的可遗传的疾病，如地中海贫血、血友病A、杜氏肌营养不良等疾病。基因治疗是目前研究单基因遗传病的治疗的一个重要方向，即通过在基因水平的改变治疗疾病。而基因编辑技术是基因治疗的新模式，可实现对基因组的定点编辑，改造人的基因，达到基因治疗的目的。目前，主要有三种基因编辑技术：ZFNs，TALENs，CRISPR。其中，CRISPR作为第三代基因组编辑工具，与前两者相比，具有更易操作、编辑效率更高、更容易获得纯合子突变体且可以在不同的位点同时引入多个突变等显著优势，因而获得了广泛的关注和应用。CRISPR/Cas系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，该系统可分为三种类型，其中类型ⅡCRISPR/Cas系统组成简单，仅需Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA、RNaseⅢ 4种成分，因此被改造为基因组靶向编辑的工具，近年来已成功应用于在体内外进行相关疾病基因的靶向修饰。CRISPR/Cas9基因编辑技术的问世极大地促进了生物医学研究的发展，为单基因遗传病的治疗带来了希望。本课题将基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，探讨通过该技术体外改造造血干细胞以治疗血液类遗传病如beta;-地中海贫血的可行性，为治疗血液类遗传病奠定理论基础。 |
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国内外研究概况 |
近年来，CRISPR/Cas9技术的出现，在基因编辑领域中引起了革命性的变革，使治愈单基因遗传病成为可能。 beta;-地中海贫血是一种血液类遗传病，主要通过常规治疗、药物治疗、异基因造血干细胞移植的方法医治，前两者无法根治该疾病，后者由于其引发的并发症而受到限制无法广泛应用，基因治疗作为一种新兴的可根治地中海贫血的方法，具有较大潜力和光明的前景。国内外诸多学者对利用CRISPR/Cas9技术治疗beta;-地中海贫血展开了相关研究和讨论。 刘华颖等对地中海贫血的基因治疗策略进行了归纳讨论，将治疗策略分为两种类型： 一种是利用患者自身的体细胞诱导成为诱导多功能干细胞（iPSCs），然后体外利用基因编辑技术将致病基因修复，再分化成为造血干细胞，然后通过回输干细胞移植实现地贫的治疗。美国简悦威实验室将beta;-地中海贫血患者来源的成纤维细胞诱导分化成iPSCs，然后针对HBB基因突变位点设计了CRISPR/Cas9载体和同源重组DNA模板，两者共转染患者iPSCs，经筛选获得了HBB基因修复后的iPSCs。结果显示，经基因修正后的细胞核型正常，在向造血细胞分化的过程中，可以高比例的生成各类造血祖细胞，并恢复beta;-球蛋白的表达。 另一种则是以造血干细胞为基因载体，即将正常的珠蛋白基因导入病变的造血干细胞，实现正常基因的表达，该策略的研究工作侧重于优化载体的构建，提高转染的效率和载体的稳定等方面，而载体的选择包括逆病毒载体（RV）、腺病毒相关载体（AAV）和慢病毒载体（LV）。另外也有研究采用非病毒载体介导的基因转移系统，Antony等在比较ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9三种基因编辑技术的靶向效率时，使用Cas9 mRNA和数个优化设计的单链寡核苷酸（ssODN）载体将特定基因导入K562细胞和CD34 造血干细胞。 各研究均表明利用CRISPR/Cas9技术治疗beta;-地中海贫血是可行的，但将CRISPR/Cas9技术真正用于临床治疗仍有困难与障碍，因此需要更多更进一步的实验研究，深入探索CRISPR/Cas9介导修复beta;-地中海贫血HBB基因突变的靶向效率、同源重组率、脱靶率等多个方面，为CRISPR/Cas9技术走向临床提供更有力的理论支撑。 |
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论文的理论依据、研究方法、研究内容 |
（一）理论依据 CRISPR/Cas9基因编辑技术本质上是利用非同源末端链接途径（NHEJ）修复和同源重组（HDR）修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列变化。 NHEJ：使双链DNA断裂，不依赖DNA同源性的情况下，在两端切口重新连接的区域插入或删除序列，这是最有效的双链DNA断裂修复途径，但该过程易出错。由于形成提早终止密码子，NHEJ经常导致染色体基因的敲除，造成功能缺失。 HDR：使双链DNA断裂后，利用外源性的同源DNA载体或同源染色体精确修复受损染色体。这一原理可以修复特定染色体或是插入一个转基因。 （二）研究方法 文献研究法、实验分析法 （三）研究内容 1、基因编辑工具的设计 2、修复模板的设计 3、细胞培养和转染 |
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研究条件和可能存在的问题 |
（二）可能存在的问题
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预期的结果 |
完成论文《基于CRISPR基因编辑技术改造造血干细胞治疗beta;-地中海贫血症的研究》 |
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论文撰写的主要内容 |
1、摘要 2、关于CRISPR/CAS9基因编辑技术和beta;-地中海贫血的简要介绍 3、实验材料和实验操作 4、实验数据及结果的分析 5、基于实验结果进行讨论 6、参考文献 |
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论文工作的进度 |
1、2020年3月21日至2020年5月20日：整理文献资料和实验数据，撰写并提交论文初稿，根据指导老师意见修改初稿。 2、2020年5月21日至2020年5月31日：论文定稿、打印、送审，准备论文答辩。 （三）答辩阶段 论文答辩的具体时间由学院确定 |
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参考文献 |
[1]孙筱放. 基因编辑——单基因遗传病治疗新策略[A]. 中国遗传学会人类与医学遗传专业委员会. 第十四次全国医学遗传学学术会议论文汇编[C]. 中国遗传学会人类与医学遗传专业委员会:中国遗传学会, 2015:3. [2]黄佳杞, 黄秦特, 章国卫. CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用研究进展[J]. 浙江医学, 2017, 39(17):1494-1498. [3]刘华颖, 李春富. 地中海贫血的基因治疗[J]. 中国实用儿科杂志, 2018, 33(12):982-984. [4]Xie F, Ye L, Chang J C, et al. Seamless gene correction of beta-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac[J]. Genome research, 2014, 24(9):1526-1533. [5]Justin S. Antony,Ngadhnjim Latifi,A. K. M. Ashiqul Haque,Andreacute;s Lamsfus-Calle,Alberto Daniel-Moreno,Sebastian Graeter,Praveen Baskaran,Petra Weinmann,Markus Mezger,Rupert Handgretinger,Michael S. D. Kormann. Gene correction of HBB mutations in CD34 hematopoietic stem cells using Cas9 mRNA and ssODN donors[J]. Justin S. Antony;Ngadhnjim Latifi;A. K. M. Ashiqul Haque;Andreacute;s Lamsfus-Calle;Alberto Daniel-Moreno;Sebastian Graeter;Praveen Baskaran;Petra Weinmann;Markus Mezger;Rupert Handgretinger;Michael S. D. Kormann,2018,5(1). [6]Ronen Ben Jehuda, Yuval Shemer, Ofer Binah. Genome Editing in Induced Pluripotent Stem Cells using CRISPR/Cas9[J]. Stem Cell Reviews and Reports(2018)14:323-336. [7]李婉影，高清平，刘会. CRISPR/Cas9系统及其在血液病基因治疗中的进展[J]. 中国实验血液学杂志，2018, 26（6）：1863-1867. [8]李焕荣，李增彦. Beta-地中海贫血CRISPR/Cas9基因治疗进展[J]. 国际妇产科学杂志, 2017(4), 44(2):185-188. [9]Weiqi Cai, Ming Wang. Engineering nuclei aid chemistry for precise and controllable CRISPR/Cas9 genome editin[J]. Science Bulletin, 2019, 64:1841-1849. [10]Yamin Li, Zachary Glass, Mingqian Huang, Zheng-Yi Chen, Qiaobing Xu. Ex Vito cell-based CRISPR/Cas9 genome editing for therapeutic applications[J]. Biomaterial, 234(2020) 119711. |
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