1. 课题目的及意义
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)是由一群紧密连锁的基因群组成，定位于动物或人某对染色体的特定区域，呈高度多态性。其编码的分子表达于不同细胞表面，参与抗原递呈，制约细胞间相互识别及诱导免疫应答。共分成两类：第一型MHC class I（MHC I）位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况，基因包括K、D、L三个座位，分布于复合体的两侧。它的产物具有抗原提呈功能，并具有多态性，直接参与T细胞的激活和分化，调控特异性免疫应答。第二型MHC class II（MHC II）只位于抗原提示细胞上，如巨噬细胞等。MHC 定位于小鼠第17号染色体的H-2，长约1500kb。
MHC I类链相关蛋白A（MICA）是由MHC基因编码的跨膜蛋白，其主要功能是作为自然杀伤细胞（NK）、细胞毒性T淋巴细胞等免疫效应细胞活化受体自然杀伤2族成员（NKG2D）的配体，能与NKG2D特异性结合，传递活化信号，诱导免疫效应细胞迅速清楚异常表达此种配体的表达细胞。本实验中MICA是一种gamma;delta;T细胞抗原，常表达于肿瘤细胞株和上皮来源的原发性肿瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌和结肠癌细胞中，在许多肿瘤细胞均有表达或上调，被视为一种肿瘤相关性抗原。NK细胞受体NKG2D结合到多样性的MHC I类相关链分子，即表达在靶细胞表面的MICA、MICB以及UL16结合蛋白ULBP1-6。通过这些配体结合的NKG2D使DAP10依赖性信号传导途径产生，并最终导致NK细胞依赖性靶细胞杀伤和促炎性细胞因子的释放。总之，NK细胞表面的NKG2D作为MICA的受体，与肿瘤细胞表面的MICA结合可以激活NK细胞介导的细胞毒性作用。
本项目研究的靶点CD24是一种广泛存在于肿瘤细胞表面的生物标记物。CD24是GPI锚定在细胞膜上的高度糖基化的蛋白分子,具有多个N-或O-连接的糖基化位点和P-选择素结合位点。近年研究提示，CD24在乳腺癌、胆管癌、胃癌、前列腺癌及大肠癌等多种实体瘤中高表达,且与肿瘤的发生发展及预后密切相关。CD24的表达不仅促进乳腺癌细胞与细胞外基质的黏附、迁移和侵袭,而且,体外和体内实验都提示CD24促进肿瘤细胞的生长和增殖。
CHO-s细胞是来自中国仓鼠卵巢(CHO K1)细胞的克隆分离株。CHO-s细胞适合在含有 L-谷氨酰胺和HT添加剂的CD CHO培养基中进行无血清悬浮培养，用于重组蛋白的瞬时或稳定表达。CHO-s仓鼠卵巢细胞增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。
近年来随着抗体技术日趋成熟，治疗性抗体作为一种具有独特优势的生物靶向治疗药物，已经成为目前全球药物研发的热点。虽然抗体药物和肿瘤治疗方法日渐增多，但是痊愈患者仍是少数。恶性肿瘤的复杂性决定了单纯的抗体治疗方案难以达到治愈病人的效果。开发抗体新靶点和新适应证，研究和设计更为安全有效的新型抗体分子及抗体组合疗法，寻找生物标记指导抗体对病人的有效治疗，是当前和今后一段时期内该领域发展的主要方向。免疫靶向治疗作为一种新颖的抗肿瘤策略已成为目前抗肿瘤药物开发的热门领域。该策略在保留亲本单克隆抗体（mAb）对肿瘤细胞杀伤作用的同时，通过将mAb偶联放射性同位素、药物或细胞因子，提高mAb介导的靶向肿瘤细胞的细胞毒性作用。
本课题的研究目标是：第一，利用基因工程和分子生物学手段获得anti-CD24 scFv-MICA稳定表达的CHO-s细胞株；第二，通过发酵工艺学原理优化发酵工艺，提高两种蛋白产量，大量制备融合蛋白；第三，运用免疫技术检验并证明anti-CD24 scFv-MICA能够特异性地覆盖于CD24 肿瘤细胞表面并激活NK细胞的免疫监视作用。
2. 研究方法
本项目将anti-CD24 scFv与MICA通过连接肽（Linker）连接，设计一种新型融合蛋白anti-CD24 scFv-MICA。anti-CD24 scFv保留原有靶向肿瘤细胞表面CD24分子的活性，同时发挥靶向性作用将MICA特异性地运载于肿瘤细胞表面，提高机体微环境中NK细胞的靶向识别能力与杀伤作用，多种肿瘤治疗机制同时发挥效力，产生更好的肿瘤治疗效果，具有广阔的应用前景。
首先利用基因技术制备anti-CD24 scFv-MICA的目的基因，并将目的基因整合至具有自我复制和选择标记的表达载体pMH3和pCApuro中，形成遗传物质重组DNA，利用高压电穿孔技术将其导入CHO-s宿主细胞中，并在其中进行复制和扩增，挑选单克隆细胞株，进行阳性筛选，连续培养十代以上，进而获得表达量稳定的细胞株，达到目的蛋白稳产。应用流式细胞术（FCM）、酶联免疫吸附剂测定（酶联免疫吸附测定）、表面等离子体共振（SPR）等技术检测anti-CD24 scFv-MICA亲和力和anti-CD24 scFv-MICA在肿瘤细胞表面的覆盖，从而评估其在小鼠体内的靶向性和检测该融合蛋白在体外激活NK细胞免疫监视作用的水平，并且在体内水平评估anti-CD24 scFv-MICA对肿瘤病灶的抗肿瘤作用和对NK细胞激活作用。
