草甘膦除草剂对夏威夷绿海龟(Chelonia mydas)肠道菌群的影响

栏外标题：草甘膦对绿海龟胃肠道细菌的影响

Ronald P. Kittle¹, Karla J. McDermid², Lisa Muehlstein², and George H.Balazs³

1夏威夷大学热带保护生物学与环境科学专业 at Hilo,200 West Kawili Street, Hilo, HI 96720-4091 USA rkittle@hawaii.edu

2夏威夷大学海洋科学系 at Hilo, 200 West Kawili Street, Hilo, HI 96720-4091 USA mcdermid@hawaii.edu, lm@hawaii.edu

3太平洋群岛渔业科学中心，国家海洋渔业服务 NOAA, 1845 Wasp Blvd., Honolulu, Hawaibdquo;i 96818 USA george.balazs@noaa.gov

通讯作者：Karla J. McDermid,电话 808-932-7599, 传真 808-932-7588, 邮箱

mcdermid@hawaii.edu

摘要：在夏威夷，经常喷洒在海岸线附近的草甘膦除草剂可能会影响非目标海洋物种。草甘膦抑制芳香氨基酸生物合成(莽草酸途径)，对牛和鸡的有益肠道细菌有毒。在体外评估了草甘膦对海洋食草龟肠道细菌的影响。当来自新鲜安乐死绿海龟(Chelonia mydas)胃肠道的混合细菌群落培养物暴露于六种草甘膦浓度(加上去离子水对照)24小时时，在草甘膦浓度ge;2.2times;10-4g L-1(在600 nm波长下测量的吸光度)时，细菌密度显著降低。使用改良的Kirby-Bauer纸片扩散法，草甘膦浓度ge;1.76times;10-3g·L-1显著抑制了四种细菌分离株(泛菌属、变形杆菌属、志贺氏菌属和葡萄球菌属)的生长。接触草甘膦的绿海龟肠道细菌生长减少或存活率降低，可能会对海龟的消化和整体健康产生不利影响。

关键字：细菌；消化；草甘膦毒性；绿龟；夏威夷；微生物群落

这项研究没有从公共、商业或非盈利部门的资助机构获得任何特定的资助。

引言

胃肠(GI)微生物对绿海龟(Chelonia mydas Linnaeus)消化大型海藻和海草食物中的复杂碳水化合物至关重要(Bjorndal 1979，Bjorndal 1980，Bjorndal 1985，Bjordal et al.1991)。绿海龟胃肠道中的微生物数量取决于多种因素，包括海龟的饮食和栖息地(Bjorndal，1985)。草甘膦或N-(膦酰基甲基)甘氨酸是世界上最常用的除草剂(Baylis 2000)，用于农业、城市、保护区和水生地区的杂草控制，因其对动物的低毒性而广为人知(Dill et al. 2010)。然而，草甘膦已被证明对一些牛肠道微生物区系有毒，会增加短链脂肪酸的产生，降低瘤胃中NH3-N的浓度，并导致牛的消化效率降低(Kruuml;ger et al. 2013, Samsel and Seneff 2013, Riede et al. 2016)。在家禽中， Shehata et al. (2013)报告了许多有益的肠道细菌，例如青春双歧杆菌、芽孢杆菌属、肠球菌属和乳杆菌属。其中一些也存在于绿海龟泄殖腔液中((Aguirre et al. 1994, Santoro et al. 2006, Keene et al. 2014, Price et al. 2107)，对草甘膦中度至高度敏感。

草甘膦抑制某些细菌的酶活性、Fe² 运输以及呼吸和生长(Roisch and Lingens 1980, Barton et al. 1982, Cahn and Leung 1986)。最值得注意的是，草甘膦抑制一种关键酶,5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate EPSP合成酶,shikimate通路中的(或莽草酸途径),植物的代谢途径,以及真菌和细菌,芳香族氨基酸的生物合成(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)所必需的蛋白质合成(Amrhein et al. 1980, Franz et al. 1997)。草甘膦与颗粒有很强的黏性，这有助于在环境中长距离运输和持久性，因为结合可能有助于保护草甘膦不被微生物降解成氨基甲基磷酸(AMPA)和二氧化碳(Balthazor and Hallas 1986, Franz et al. 1997, Schuette 1998)。受除草剂污染的城市地区的雨水和废水可以将草甘膦输送到接收水域(Kolpin et al. 2006, Botta et al. 2009, Zgheib et al. 2012)。夏威夷希洛(Hilo)附近的沿海地区年平均降雨量为3303毫米，年降水量约为275天(Giambelluca et al. 2013)，易受季节性山洪暴发和径流的影响，这可能会将草甘膦输送到沿海水域。在佛罗里达州的实验中,草甘膦在有海洋细菌种群的海水中的半衰期为47天(25℃在光线暗的)最长到310天(31°C 黑暗)(Mercurio et al. 2014)。得出这样的结论：“在热带地区的洪水羽流期间，预计不会有什么退化，这可能会把溶解的和沉积物，包括草甘膦”输送到海洋环境中。2004年春季，在法国大西洋沿岸Marennes-Oleacute;ron湾的一次径流事件中，在11天期间(最大浓度= 1.2 x 10-6 g Lminus;1)检测到低水平的草甘膦(burgot et al. 2007)。Skeff et al. (2015)在2012年波罗的海10个河口的水样中观察到草甘膦的浓度为2.8 times; 10-8至1.69 times; 10-6 g Lminus;1,AMPA的浓度为4.5 times; 10-8至4.16 times; 10-6 g Lminus;1。这些研究表明，可测量数量的草甘膦及其主要代谢物可以运输到沿海环境，海洋物种可能暴露于污染物。

在夏威夷群岛，公共和私人部门经常喷洒草甘膦类除草剂(e.g. Roundupreg; and Rodeoreg;)，以对抗道路沿线、庭院、高尔夫球场、农田以及淡水、海洋和近海岸线附近不受欢迎的或入侵的植被。尽管，据我们所知，在夏威夷群岛的沿海水域没有测试过草甘膦，这种化合物可能会到达沿海水域并影响非目标海洋物种，如绿海龟、它们的食物植物甚至可能是它们的胃肠细菌群落。夏威夷群岛上的绿海龟由一个基因和地理上离散的亚种群组成，在过去40年里数量有所回升(Balazs et al. 2015)，但在一些近海岸觅食区域，绿海龟的躯体生长有所减少(Balazs and Chaloupka 2004)。只有少数研究记录了草甘膦对爬行动物的影响，如石龙子、蜥蜴和淡水龟(Sparling et al. 2006, Carpenter et al. 2016, Schaumburg et al. 2016)，所有研究都涉及直接、局部涂抹草甘膦到卵或皮肤。 Douros et al. (2015)在啮龟组织中发现了可测量的草甘膦含量，低于水柱中的草甘膦浓度。这些研究都没有检验草甘膦对爬行动物肠道细菌的影响。没有研究评估草甘膦对海龟或它们的胃肠道细菌群落的影响。

本研究的目的是量化绿海龟胃肠道中微生物对草甘膦基除草剂的敏感性。假设为:1)草甘膦对细菌群落产生负向影响;2)绿海龟中不同类群的细菌对草甘膦的敏感性不同;3)草甘膦对细菌生长的抑制作用依赖于草甘膦浓度。、

方法

在美国地质调查局野生动物病理学家蒂埃里·沃克博士(Thierry Work)和美国国家海洋和大气管理局(NOAA)的国家海洋渔业局(National Marine fishery Service)的合作评估后，因致命伤害或绝症而需要实施安乐死8只绿海龟，它们在死后立即成为该项目的捐赠者(Work 2014)。由于受到美国濒危物种法案的严格保护，没有人试图从海上捕获自由放养的海龟进行安乐死。所有的6只海龟的肠道样本中都有海藻，没有任何腐烂食料的迹象(硫化氢气味)。研究人员在夏威夷主岛的几个地点收集了海龟，有雄性的，也有雌性的，甲壳的长度从49厘米到74厘米不等。在胃肠道(作物、胃、小肠、盲肠和大肠)的5个位置采集微生物样本，在每个胃肠道区域的内部擦拭2个无菌棉签。1支拭子置于BD BBL Vacutainer TM厌氧标本收集器(Becton, Dickinson and Company)内，2支拭子置于营养琼脂培养基上运输，4小时内在营养琼脂上重新划线。在30°C的好氧和厌氧条件下培养。

2016年5月10日，将瓦胡岛海莱瓦市14.7公斤雄性海龟(病例#25338)盲肠的混合菌群在30℃的营养液中培养。整除(1.0毫升)的混合细菌社区文化在一式三份接种到50毫升离心管包含40毫升营养肉汤 草甘膦浓度低的代表(2.2 x身手和4.4 x10-4尤其g Lminus;1),介质5.6 x 10 - 2和0.1125 g Lminus;1)和高(1.8和3.6 g Lminus;1)浓度的草甘膦。本实验草甘膦的来源为Rodeoreg;，是Dow AgroSciences生产的一种草甘膦基除草剂的品牌名称，其活性成分为53.8%的草甘膦异丙胺盐。选择Rodeoreg;除草剂是因为它不含表面活性剂，推荐在水生场所和湿地及其周围使用。草甘膦浓度被选择为接近欧洲沿海环境报告的数量(伯格特等人2007年，Skeff等人2015年)，并包括制造商推荐的0.75%的Rodeoreg;浓度(=草甘膦浓度3.6 g L-1) (Rodeoreg;标签)。对照组草甘膦浓度为0 g L-1。初始混合细菌群落密度的评估方法是使用贝克曼DU-600分光光度计在600 nm波长下测量样品的吸光度，类似于monke等人(2010)所描述的方法。选择600 nm的波长是由于600 nm处营养液的干扰最小。24小时后，通过测定样品在600 nm处的光密度，重新评估添加草甘膦和不添加草甘膦的细菌群落。采用反正弦变换对不同浓度草甘膦处理对细菌群落生存和生长的影响进行归一化处理，并采用单因素方差分析和事后检验进行分析。

使用麦康凯琼脂(用于分离肠杆菌科)、甘露醇盐琼脂(用于分离葡萄球菌种)和去氧氯酸木糖赖氨酸(XLD)琼脂(用于分离沙门氏菌和志贺氏菌种)从原始样品中分离单个细菌菌落。平板在30°C的12-140E培养箱(昆西实验室)中有氧培养。通过革兰氏染色和以下生化反应对分离菌落进行鉴定(BD Cat.no.261185)，氧化酶生产(BD Cat.no.261181)和Voges-Proskauer A amp; B试剂 (BD Cat. no. 261192 and 261193)。通过Enteropluri检测试剂盒(Becton, Dickinson and Company, Cat. no. L010570)对革兰氏阴性菌进行鉴定。这是一种含有特殊培养基的12扇区系统，可用于鉴定肠杆菌科和其他革兰氏阴性、氧化酶阴性细菌。培养物在36℃下培养，18小时后根据制造商说明进行检查。

Kirby-Bauer磁盘扩散试验方法 (Bauer et al. 1966) 被用来确定不同浓度的草甘膦的影响四个从原始胃肠道细菌类群孤立的领域(农作物、胃、小肠、盲肠或大肠)从海龟8安乐死5月13日,2015年9月29日,2015年11月1日2015(案例# 25196、25197、25245、25246和25254年)。如前款所述，这4个类群包括:Pantoea sp.(肠杆菌科成员，参与鱼类、昆虫、螃蟹、甲壳纲动物、鸡、牛、牛和熊猫等宿主动物的生物降解和发酵)(Walterson and Stavrinides 2015);变形杆菌，一种革兰氏阴性异养兼性厌氧菌，正常肠道菌群中的共生或中性共生菌。(Drzewiecka 2016);志贺氏杆菌属，一种常见的革兰氏阴性、不活动的胃肠道细菌;葡萄球菌，一种革兰氏阳性，非致病菌或致病菌参与碳水化合物分解(straster和Winkler 1963)。15种系列稀释草甘膦基除草剂(Rodeoreg;)导致草甘膦浓度从2.2 x 10^-4到3.6 g·L^-1在500毫升瓶中使用无菌去离子水配制。这些草甘膦浓度被选择为接近法国和波罗的海沿海水域报告的最大浓度(Burgeot et al. 2007, Skeff et al. 2015)，并包括制造商推荐的0.75%的Rodeoreg;浓度(=草甘膦浓度3.6 g L-1) (Rodeoreg;标签)。每个细菌分类的分离物被散布在“草坪”上，覆盖在培养皿的营养琼脂上，然后立即将三个在特定浓度草甘膦中浸泡10秒的滤纸盘牢牢地放置在有条纹的培养皿表面。在每个有条纹的培养皿的中心放置另一个用无菌去污水浸泡过的滤纸盘作为对照。使用6个重复的培养皿，对4种细菌的每种浓度(共360个培养皿)进行处理。文化孕育了18个小时30°C和抑制测量的任何区域(图1)。平均区每个浓度为每一个细菌的抑制作用是由平均直径没有增长的“光环”的六个培养皿(n = 18磁盘/浓度)。单向方差分析用于检测不同浓度之间生长抑制区的差异，并进行图基事后检验。

结果

在细菌群落实验中，样品中的高吸光度表示营养肉汤中的高细菌密度，所有样品的初始吸光度为0.614或更大。24小时后，与对照相比，所有草甘膦剂量的吸光度都显示出显著的负变化(=细菌群落密度降低)(图2)。吸光度增加(平均值= 0.17plusmn;2.32)。最低观测效应水平(LOEL)为2.2times;10-4g·L^-1，未确定无观测效应水平(无观测效应水平)。用草甘膦浓度ge; 0.1125克每升培养的细菌群落显示吸光度减少70%或更多。

从柯比-鲍尔分

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