从黄瓜的茎尖外植体直接诱导芽器官发生并在体外开花外文翻译资料

从黄瓜的茎尖外植体直接诱导芽器官发生并在体外开花

P. Sangeetha amp; P. Venkatachalam

毕利亚尔大学生物技术系植物基因工程与分子生物学实验室

摘要：离体开花技术克服了种间不亲和性所带来的种间限制，是黄瓜杂交种选育的一种新方法。本研究以黄瓜茎尖为外植体，探讨了一种有效的多芽诱导和试管开花的方法。以7日龄幼苗茎尖为外植体，分别在Murashige和Skoog（MS）培养基上单独加入不同浓度的6-苄氨基嘌呤（BAP；0.5-2.5mg/L）或与激动素（KIN）共同培养，研究了6-苄氨基嘌呤（BAP）对幼苗茎尖外植体生长的影响。在附加1.0mg/L BAP的MS培养基上，多芽形成频率最高（93.1%），芽数最大（15.2芽/外植体）。在 MS培养基上加入0.5mg/L BAP 和不同浓度的蔗糖进行试管开花。在 MS 6%（w/nu;）蔗糖 0.5mg/L BAP培养基上，约95% 的试管苗在15d 后开花。为了生根，将芽（gt; 2cm）在MS培养基上单独培养或与0.5mg/L KIN混合各种浓度的吲哚-3-丁酸（IBA；0.5–2.5mg/L）培养。在试验的组合中，添加了IBA（1.5mg/L）和KIN（0.5mg/L）的组合诱导产生最大生根率（95.4％），有7.8个根/芽。将生根的幼苗成功地转移到装有土壤和沙子的混合物（1：1）的塑料杯中，在温室中建立，随后在田间驯化。本研究报道的离体开花技术可以促进黄瓜属植物的快速杂交，为研究黄瓜开花的生理机制提供了一个模型系统。

关键词：黄瓜；生长激素；试管开花；多芽再生；茎尖外植体

引言

黄瓜（Cucumis sativus L.），属于葫芦科，是印度一种重要的园艺作物，主要作为蔬菜种植，用于切片、腌制和提取汁液制备印度传统药物。在过去的二十年里，这一重要的园艺物种的遗传工程改造方案通过器官发生而得到优化，使作物得以改良。因此，直接器官发生再生是黄瓜大量繁殖的首选方法。建立快速高效的再生体系是将新基因定向导入黄瓜植株的前提之一。

有报道称从黄瓜植株再生芽使用诸如花药的各种外植体（Kuma等2003），子叶（Selvaraj等2007），芽尖（Vasudevan等2004），下胚轴（Selvaraj等2006）和节段（Kontas和Kintzios2003；Ahmad和Anis2005）。虽然有关于组织培养的报道，但成功率较低（Vasudevanetal2004）。因此，迫切需要开发一种用于这种重要作物的高频植物再生方案。

体外开花被认为是一个复杂的过程，通过同步开花和结实率来实现远缘品种的快速杂交已成为一种替代工具（Venkatachalam和Jayabalan1996；Stephen和 Jayabalan1998）。香菜的体外发育花显示出与体内植物的花朵具有相似的形态，并且种子成功发育（Stephen和Jayabalan 1998）。为了缩短植物生命周期的持续时间，将诱导体外开花和结实。有利于作物改良（Stephen和Jayabalan1998）。体外开花是许多遗传育种的前提操作方法，也可以用来改善关于开花生理的知识（Victoria和Lage 2009）。此外，离体开花对选择性杂交具有重要意义，特别是在使用稀有种质的花粉供体时。有价值的特征在栽培的黄瓜基因库中找不到，因此野生黄瓜与栽培黄瓜的种间杂交已被广泛用于作物改良（Lebeda等2007）。据报道各种农作物都有体外开花，花生（Venkatachalam和Jayabalan1996；Asawaphan等2005），黄瓜（Rajasekaran等1983），苦瓜（Wang等2001），香菜（Stephen和Jayabalan1998），籼稻（Cha-um等2012）和小扁豆（Sarker等2012）。另外，最近有好几个尝试开发转基因黄瓜植物（Gaba等.2004；Vengadesan等2005；Selvaraj等2010）。虽然黄瓜下胚轴外植体的体外开花之前已有报道，但尚未有关于体外从C. sativus的茎尖外植体开花的报道。本文研究了不同浓度的细胞分裂素和生长素对黄瓜茎尖多芽诱导和离体开花的影响。

材料和方法

植物材料。黄瓜种子（C. sativus L. cv lsquo;Green longrsquo;）浸泡在自来水中1小时，然后用10％的水洗涤 （nu;/nu;）商业洗涤剂Tween 20洗涤10分钟，然后用蒸馏水冲洗3次。用0.1％（w/nu;）氯化汞溶液将种子进一步消毒5分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗5次以去除痕量汞氯化物。最后，将种子在无菌的1号Whatmann滤纸上吸干。将消毒过的种子放在装有无菌湿棉的培养管（25times;150 mm）中的培养基上，用不吸收棉的棉塞紧紧塞住，然后在黑暗中发芽。

培养基和条件。本研究使用的所有培养基均基于含有3％（w/nu;）蔗糖的MS培养基（Murashige和Skoog 1962）。培养基中进一步增加了各种浓度和生长调节剂的组合，生长调节剂有6-苄氨基嘌呤（BAP），激动素（KIN）和吲哚-3-丁酸（IBA）。在用0.8％（w/nu;）的琼脂固化之前，将培养基的pH调节至5.8。将熔化的培养基以每管15mL分散到培养管（25times;150 mm）中，并用不吸收的棉塞紧密塞住，然后在121℃，15 psi下高压灭菌20分钟。将体外培养物保持在25plusmn;2℃下16/8-h（光照/黑暗）在60mu;Em^-2 bull;s^-1下通过冷白色荧光灯管产生的光周期。

多芽起始。从7 d龄的幼苗中取出茎尖外植体，单独培养在添加了不同浓度BAP的MS培养基上，BAP的浓度梯度为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mg/L，或与0.5mg/L KIN联合培养。再生的枝条每隔2周传代到相同成分的新鲜培养基上。随后，在相同的培养基组成上，芽从芽簇中伸长。芽块在新鲜芽增殖培养基上每隔15d反复传代，多芽生长快，芽数多。

体外开花。切下来自嫩芽团块（28d龄）发育良好的嫩芽，并将其培养到用不同浓度的蔗糖（2％，3％，4％，5％或6％，w/nu;），硝酸铵（8.25-33g/L），硝酸银（1.7-6.8mg/L）以及0.5mg/L的BAP强化的新鲜MS培养基中，用于体外开花。培养3周后，记录开花的百分率。

表1BAP 和 KIN对黄瓜茎尖多芽诱导的影响

在同一栏内同一字母后的平均数在（p le;0.05）时无显著差异。

^a数值代表平均值plusmn;标准误差。

生根和适应。在生根诱导过程中，将3片或4片叶的长枝（gt; 2cm）在不加激素的1/2 MS 培养基上单独培养，或与0.5mg/L 的KIN混合培养，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L的IBA。为了适应环境，在流动的自来水中除去残留的琼脂后，从培养管中取出发育良好的幼苗，并转移到装有无菌沙子和花园土壤（1：1）的塑料杯中。将塑料杯用聚乙烯袋覆盖，并保存在培养室中以保持高湿度。30天后，将幼苗转移到装有有机肥的花园土壤的盆中，并在温室中再放置2周。适应环境15天后，将幼苗转移到田间条件下，使其正常生长。

统计分析。数据（平均值plusmn;标准差）是从两次实验（每次处理20个外植体）中收集的。基于视觉观察，记录了多芽诱导、离体开花和生根的培养百分比，并进行统计学分析。所有实验均采用完全随机区组设计。统计分析软件（SAS）程序用于确定5% 水平的显著性。

结果与讨论

多芽再生。在补充了不同浓度BAP（0.5-2.5 mg/L）的MS培养基上单独或与0.5mg/L KIN组合诱导了来自芽尖外植体的多个芽。表1给出了芽尖外植体的形态发生相应变化。在所有使用了BAP浓度下均观察到芽再生，培养42天后，在含有1.0mg/L BAP的MS培养基上发生芽芽繁殖是最高频率（93.1％）和发生芽的数量是最高（15.2芽/外植体）。当BAP浓度高于1.0mg/L时，芽的数量减少（表 1；图 1a，b）。与单独的BAP相比，BAP和KIN的组合能使每个植株的芽减少。在BAP和KIN组合的情况下，在含有1.0mg/L BAP和0.5mg/L KIN的MS培养基上观察到多芽再生的最大百分比（87.3％），这也产生了最大芽数（8.75芽/外植体）。

图 1。黄瓜茎尖外植体再生植株的研究。（a）芽萌发（14-d-old culture）。（b）用1.0 mg/L BAP （42-d-old）在MS培养基上诱导不定芽再生。（c）再生芽的伸长。（d和e）生根苗在含1.0mg/L IBA 和0.5mg/L KIN 的1/2 MS 培养基上生根生（f）生根植物生长在塑料杯中，土壤与沙子的比例为1:1。

据报道，在培养基中补充细胞分裂素（如BAP和KIN）对于不定芽再生以及在葫芦科中的体外繁殖至关重要。Ananthakrishnan等（2003）报道BAP（1.0mg/L）在南瓜（Cucurbita pepo）中产生最大芽，Saha等人（2007）描述了BAP（2.0mg/L）和KIN（1.0mg/L）的协同作用增强了瓠瓜（Lagenaria siceraria）的嫩芽再生频率。Vasudevan等（2001）报道，BAP浓度

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