ACSL4调控肝癌细胞炎症及氧化应激的作用研究开题报告

 2023-08-27 23:30:32

1. 研究目的与意义

研究现状及发展趋势

原发性肝癌是人类常见的恶性肿瘤之一,发病率居恶性肿瘤第5 位,特别是在中国发病率位于恶性肿瘤前三位,每年有近六十万新增病例[1]。肝癌主要风险因素包含年龄、性别、饮酒、肝硬化以及b 型肝炎或c 型肝炎病毒的慢性感染等[2, 3]。肝癌的治疗目前仍以手术切除为主,但患者术后五年内70%的转移复发一直是制约患者预后生存的主要瓶颈[4]。靶向药物如索拉非尼[5]已被美国fda批准用于晚期肝癌的治疗,疗效确切,可有效延长患者的生存期,但缺点是患者很容易出现耐药[6],此外,靶向药物价格昂贵,给患者的家庭带来沉重负担。因此,挖掘新型的肝癌靶标,并以此开发出有效的治疗药物尤为关键。

长链脂酰辅酶a合成酶4(acsl4)是脂酰辅酶a合成酶家族的成员之一,在花生四烯酸的代谢中发挥关键的作用,能够将脂肪酸转换成脂肪酸脂酰辅酶a酯[7]。研究发现,acsl4在类固醇生成组织中过量表达,而在一些胃肠系统如肝脏中低表达[8]。此外,研究还发现acsl4的表达失调与多种恶性肿瘤的发病密切相关,如乳腺癌、胃癌、结肠癌等[9, 10]。有趣的是,acsl4在胃癌中发挥抗肿瘤作用[11],而在乳腺癌及前列腺癌的发生及转移中则发挥促癌作用[12],表明acsl4与癌症发生之间的关系较为复杂。纵观国、内外研究,尚未见acsl4调控肝癌炎症及氧化应激的研究报道。

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2. 研究内容和问题

基本内容

western blot检测五种人肝癌细胞(bel-7402、mhcc-97-h、smmc-7721、hepg2及huh-7)中acsl4的蛋白表达;分别采用过表达及干扰acsl4质粒转染hepg2细胞,通过western blot进行过表达及干扰效果的验证;采用elisa实验研究过表达及干扰acsl4对hepg2细胞分泌il-6及il-1β的影响;采用western blot检测过表达及干扰acsl4对hepg2细胞中炎性相关蛋白inos和cox-2蛋白表达影响;采用试剂盒检测过表达及干扰acsl4对hepg2细胞中ros、mda、及gsh水平影响以及对抗氧化酶cat、gpx及sod活性影响。

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3. 设计方案和技术路线

研究方法

1.western blot检测蛋白表达

1)蛋白提取:取培养好的细胞用pbs清洗三次,加入300 μl的np40蛋白裂解液(含1 mm的pmsf),用细胞刮刮取2分钟,吸取放入离心管中,放入-20冰箱过夜。第二天,取出离心管放冰上融化,并放在4℃,12000 rpm,离心15 min取上清液;2)bca蛋白定量:设置空白孔、标准曲线(0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 μg/μl)、稀释10倍的样品孔,加入bca工作液37 ℃孵育30 min后562 nm处测定od值。按照样品体积加入相应体积的5×上样缓冲液,混匀后95 ℃煮蛋白10 min,冷却存于-80 ℃超低温冰箱中;3)上样、电泳及转膜:根据不同的抗体决定不同的上样量(20~50 μg),恒压80v进行电泳。结束后将胶转移至pvdf膜上,恒流260 ma低温湿转90 min;4)封闭及孵育抗体:将pvdf膜沉没在5 %的脱脂奶粉中常温封闭2小时后,每10 min用tbst洗膜1次,共3次。吸干pvdf膜上的残留液体置于塑封膜当中,加入相应的一抗(acsl4)后封口,放置于4℃冰柜中摇床过夜;5)敷荧光二抗及显影:回收一抗,tbst洗膜3次后每张膜加入2ml的荧光二抗(1:5000)室温避光孵育2 h,再次用tbst洗3次,li-cor显影机显影,image j分析条带。

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4. 工作计划

研究工作条件

1.项目成员已经熟练掌握本实验所需要的实验技术;

2. 本项目研究将依托于南通大学药学院药理平台,实验室具备常规开展细胞学及分子生物学等实验项目的条件,为本研究有关项目的实施提供保障;指导老师长期从事肿瘤基础药理研究,擅长各种肿瘤模型的构建,具有较好的分子生物学研究基础,对整个课题研究具有很好的把控。

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