ACSL4调控结肠癌血管生成的作用研究开题报告

1. 研究目的与意义

研究现状及发展趋势：

结肠癌是临床常见的一种消化道系统恶性肿瘤，严重威胁人们的健康^[1]。目前临床上结肠癌的治疗方法主要包括手术、放化疗及免疫疗法等，但这些方法都有较为明显的缺点，如手术切除只适应于尚未发生转移患者，对于已转移的患者无效^[2]；化疗药物在临床经常会引起毒副作用，包括神经毒性及肾毒性等^[3]；近年来兴起的免疫疗法尤其是免疫检查点抑制剂，临床研究发现其对大部分实体瘤不响应^[4]。因此，深入挖掘结肠癌的发病机理，找寻潜在的结肠癌治疗靶点迫在眉睫。

长链脂酰辅酶a合成酶4（acyl-coa synthetase long-chain family member 4, acsl4）是脂酰辅酶a合成酶家族的成员之一，在花生四烯酸的代谢中发挥关键的作用，能够将脂肪酸转换成脂肪酸脂酰辅酶a酯^[5]。研究发现，acsl4在类固醇生成组织中过量表达，而在一些胃肠系统如肝脏中低表达^[6]。此外，研究还发现acsl4的表达失调与多种恶性肿瘤的发病密切相关，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌等^{[7, 8]}。有趣的是，acsl4在胃癌中发挥抗肿瘤作用^[9]，而在乳腺癌及前列腺癌的发生及转移中则发挥促癌作用^[10]，表明acsl4与癌症发生之间的关系较为复杂。纵观国、内外研究，尚未见acsl4与结肠癌血管生成生成之间关系的研究报道，前期我们通过初步研究，发现acsl4能够在结肠癌细胞中调控结肠癌的血管生成，但具体的作用机制尚不明确。

2. 研究内容和问题

基本内容：

western blot检测6种人结肠癌细胞中acsl4的蛋白表达；采用过表达质粒转染低表达acsl4的细胞株，采用干扰质粒转染高表达acsl4的细胞株，通过western blot进行过表达及干扰效果的验证；采用小管形成研究过表达及干扰acsl4对结肠癌血管生成影响；采用western blot检测过表达及干扰acsl4对结肠癌细胞中hedgehog信号关键蛋白patched、smo及hhip表达影响；elisa检测过表达及干扰acsl4对结肠癌细胞shh分泌影响；在过表达及干扰acsl4细胞中，联用hedgehog信号激动剂sag及抑制剂环靶明，明确hedgehog信号在acsl4调控血管生成中的作用。

3. 设计方案和技术路线

研究方法：

1．western blot检测蛋白表达

1）蛋白提取：取培养好的细胞用pbs清洗三次，加入300μl的np40蛋白裂解液（含1 mm的pmsf），用细胞刮刮取2分钟，吸取放入离心管中，放入-20冰箱过夜。第二天，取出离心管放冰上融化，并放在4℃，12000 rpm，离心15 min取上清液；2）bca蛋白定量：设置空白孔、标准曲线（0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5μg/μl）、稀释10倍的样品孔，加入bca工作液37℃孵育30 min后562 nm处测定od值。按照样品体积加入相应体积的5×上样缓冲液，混匀后95 ℃煮蛋白10 min，冷却存于-80℃超低温冰箱中；3）上样、电泳及转膜：根据不同的抗体决定不同的上样量（20~50μg），恒压80v进行电泳。结束后将胶转移至pvdf膜上，恒流260 ma低温湿转90 min；4）封闭及孵育抗体：将pvdf膜沉没在5 %的脱脂奶粉中常温封闭2小时后，每10 min用tbst洗膜1次，共3次。吸干pvdf膜上的残留液体置于塑封膜当中，加入相应的一抗（acsl4、patched、smo、hhip）后封口，放置于4℃冰柜中摇床过夜；5）敷荧光二抗及显影：回收一抗，tbst洗膜3次后每张膜加入2ml的荧光二抗（1：5000）室温避光孵育2 h，再次用tbst洗3次，li-cor显影机显影，image j分析条带。

4. 研究的条件和基础

研究工作条件和基础：

1.项目成员已经熟练掌握本实验所需要的实验技术；

2.本项目研究将依托于南通大学药学院药理平台，实验室具备常规开展细胞学及分子生物学等实验项目的条件，为本研究有关项目的实施提供保障；指导老师长期从事肿瘤基础药理研究，擅长各种肿瘤模型的构建，具有较好的分子生物学研究基础，对整个课题研究具有很好的把控。