ACSL4调控肝癌细胞炎症及氧化应激的作用研究开题报告

1. 研究目的与意义

研究现状及发展趋势：

原发性肝癌是人类常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤第5 位，特别是在中国发病率位于恶性肿瘤前三位，每年有近六十万新增病例^[1]。肝癌主要风险因素包含年龄、性别、饮酒、肝硬化以及b 型肝炎或c 型肝炎病毒的慢性感染等^{[2, 3]}。肝癌的治疗目前仍以手术切除为主，但患者术后五年内70%的转移复发一直是制约患者预后生存的主要瓶颈^[4]。靶向药物如索拉非尼^[5]已被美国fda批准用于晚期肝癌的治疗，疗效确切，可有效延长患者的生存期，但缺点是患者很容易出现耐药^[6]，此外，靶向药物价格昂贵，给患者的家庭带来沉重负担。因此，挖掘新型的肝癌靶标，并以此开发出有效的治疗药物尤为关键。

长链脂酰辅酶a合成酶4（acsl4）是脂酰辅酶a合成酶家族的成员之一，在花生四烯酸的代谢中发挥关键的作用，能够将脂肪酸转换成脂肪酸脂酰辅酶a酯^[7]。研究发现，acsl4在类固醇生成组织中过量表达，而在一些胃肠系统如肝脏中低表达^[8]。此外，研究还发现acsl4的表达失调与多种恶性肿瘤的发病密切相关，如乳腺癌、胃癌、结肠癌等^{[9, 10]}。有趣的是，acsl4在胃癌中发挥抗肿瘤作用^[11]，而在乳腺癌及前列腺癌的发生及转移中则发挥促癌作用^[12]，表明acsl4与癌症发生之间的关系较为复杂。纵观国、内外研究，尚未见acsl4调控肝癌炎症及氧化应激的研究报道。

2. 研究内容和问题

基本内容：

western blot检测五种人肝癌细胞（bel-7402、mhcc-97-h、smmc-7721、hepg2及huh-7）中acsl4的蛋白表达；分别采用过表达及干扰acsl4质粒转染hepg2细胞，通过western blot进行过表达及干扰效果的验证；采用elisa实验研究过表达及干扰acsl4对hepg2细胞分泌il-6及il-1β的影响；采用western blot检测过表达及干扰acsl4对hepg2细胞中炎性相关蛋白inos和cox-2蛋白表达影响；采用试剂盒检测过表达及干扰acsl4对hepg2细胞中ros、mda、及gsh水平影响以及对抗氧化酶cat、gpx及sod活性影响。

3. 设计方案和技术路线

研究方法：

1．western blot检测蛋白表达

1）蛋白提取：取培养好的细胞用pbs清洗三次，加入300 μl的np40蛋白裂解液（含1 mm的pmsf），用细胞刮刮取2分钟，吸取放入离心管中，放入-20冰箱过夜。第二天，取出离心管放冰上融化，并放在4℃，12000 rpm，离心15 min取上清液；2）bca蛋白定量：设置空白孔、标准曲线（0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μg/μl）、稀释10倍的样品孔，加入bca工作液37 ℃孵育30 min后562 nm处测定od值。按照样品体积加入相应体积的5×上样缓冲液，混匀后95 ℃煮蛋白10 min，冷却存于-80 ℃超低温冰箱中；3）上样、电泳及转膜：根据不同的抗体决定不同的上样量（20~50 μg），恒压80v进行电泳。结束后将胶转移至pvdf膜上，恒流260 ma低温湿转90 min；4）封闭及孵育抗体：将pvdf膜沉没在5 %的脱脂奶粉中常温封闭2小时后，每10 min用tbst洗膜1次，共3次。吸干pvdf膜上的残留液体置于塑封膜当中，加入相应的一抗（acsl4）后封口，放置于4℃冰柜中摇床过夜；5）敷荧光二抗及显影：回收一抗，tbst洗膜3次后每张膜加入2ml的荧光二抗（1：5000）室温避光孵育2 h，再次用tbst洗3次，li-cor显影机显影，image j分析条带。

4. 工作计划

研究工作条件：

1.项目成员已经熟练掌握本实验所需要的实验技术；

2. 本项目研究将依托于南通大学药学院药理平台，实验室具备常规开展细胞学及分子生物学等实验项目的条件，为本研究有关项目的实施提供保障；指导老师长期从事肿瘤基础药理研究，擅长各种肿瘤模型的构建，具有较好的分子生物学研究基础，对整个课题研究具有很好的把控。