脂肪酶细胞表面展示型全细胞催化剂的表征方法研究开题报告

1. 研究目的与意义

构建目的蛋白在细胞表面展示固定的全细胞催化剂已经成为近年来现代分子生物学及生物催化领域的热点研究和前沿性研究。细胞表面展示蛋白的表征分析是这一研究领域的重要内容之一，但迄今为止尚未研究获得一种既可定性又可定量的细胞表面展示的表征分析方法技术。

本研究拟采用X-射线光电子能谱结合WesternBlot和激光共聚焦显微镜分析，对脂肪酶在毕赤酵母细胞表面的展示进行表征分析研究，通过对比研究，开发一种新型的细胞表面展示定性和定量研究方法，为细胞表面展示技术的发展提供重要的支撑，研究具有较重要的理论和实践意义。

2. 国内外研究现状分析

1 脂肪酶的噬菌体表面展示

噬菌体展示系统是最早研究得比较成熟的展示系统，虽然噬菌体展示系统从丝状噬菌体发展到t4、t7和λ噬菌体等表面展示系统，能展示的蛋白越来越大，其应用也日渐广泛，但主要还是集中在对突变文库等的筛选研究上。最早的报道是danielsen等利用丝状噬菌体外壳蛋白pⅢ为载体蛋白将约32kda的脂肪酶展示在丝状噬菌体表面。随后，droge等曾尝试在噬菌体表面展示铜绿假单胞菌和产碱假单胞菌脂肪酶，但是没有获得成功。之后他们利用同样的丝状噬菌体展示系统成功展示了没有盖子结构域的小分子枯草杆菌脂肪酶lipa，以对硝基苯酚辛酸酯为底物测定了酶的km和转换数，结果显示与自由酶相比，km无变化，而转换数则由自由酶的18molecules／lipases提高到84molecules/lipases。

2 脂肪酶的细菌表面展示

3. 研究的基本内容与计划

1、以毕赤酵母为载体的脂肪酶表面展示型全细胞催化剂的构建；

2、采用westernblot、激光共聚焦显微镜及x-射线光电子能谱仪分别对脂肪酶在毕赤酵母细胞表面的展示情况进行表征分析，并对其进行对比研究；

3、选择一种理想的表征方法，对细胞表面展示蛋白进行半定量或定量分析,探讨不同锚定蛋白及展示方法对脂肪酶细胞表面展示的影响。

4. 研究创新点

目前，还没有使用X-射线光电子能谱仪对展示的脂肪酶进行表征分析的实例，本次试验首次采用X-射线光电子能谱仪对脂肪酶的表面展示体系进行表征分析。