1. 研究目的与意义
灰霉病是葡萄生产中危害最大的病害之一,发生普遍,并随着设施栽培面积的扩大而日益严重。葡萄灰霉病不仅是生产田中常见病害,更是产后贮藏过程中的毁灭性病害。虽然有高效杀菌剂和先进的贮藏技术,但每年因灰霉病造成的葡萄产后损失依然高达50%,一般损失在20%￣30%左右。
葡萄灰霉病症状田间灰霉病菌主要危害花冠、花序和果实,也能危害幼叶。花序发病初期病部呈淡褐色,随后变暗褐色软腐病萎蔫,严重时整个花序坏死,表面密生灰色霉,稍一触动,即可到处飞扬。葡萄灰霉病在田间通常造成落花落果和果实腐烂。贮藏阶段,浆果染病早期在果皮上出现直径2～3 mm的圆形凹陷病斑,果肉仍维持原有硬度,病斑颜色稍浅于周围的正常组织。用手轻擦病斑部位,可见表皮易与果肉分离而发生局部脱落,如果用手按压病斑则病处表皮破裂果肉暴露。葡萄一旦染病后病程发展十分迅速、难以控制。在适宜发病的环境条件下几天后即发生落粒和果实软腐,果皮上开始聚积并产生大量灰至浅黄色的菌丝和分生孢子的现象,使果实完全失去商品价值。
运用lamp研究灰葡萄孢的优点有：1.灵敏度高；2.特异性强；3.速度快；4.设备简单；5.操作简便
2. 国内外研究现状分析
LAMP技术是通过两对特殊设计的引物,利用BstDNA聚合酶的链置换活性提供反应的动力,在恒温条件下完成对目标DNA的大量扩增。反应的关键在于茎环结构的形成,内引物通过结合到茎环结构环状区域的互补序列上,在BstDNA聚合酶作用下合成延伸并发生链置换。由于没有常规PCR的退火、复性过程,因此反应可在恒温下进行。
灰葡萄孢霉侵染能力很强,在有伤口和无伤口的情况下,都能产生有效侵染。童蕴慧等用菌丝块无伤接种法将灰葡萄孢霉接种于番茄叶片上检测其致病力;李喜玲等采用菌丝块刺伤接种法测定不同寄主来源的灰葡萄孢霉对番茄果实和叶片的致病力,并采用滤纸保湿;Pinedo等用105 mL-1的灰葡萄孢霉孢悬液接种于葡萄果粒拔出果柄后留下的伤口,测定病菌的致病力。采用孢悬液接种,灰霉病发病速度快,24～48h即可发病并观察,但是配置一定孢子数密度悬液的工作量较大;采用菌丝块无伤接种法,灰霉病发生迟,一般72h后才能使果粒发病;而采用菌丝块刺伤接种法,在接种后的60～80h即为最适的致病力观察和测量时间。因此,为了快速、简便的检测灰葡萄孢霉在葡萄果粒上的致病力,采用菌丝块刺伤接种法,并确定葡萄果粒的最佳消毒方法:φ=70%乙醇消毒1min,w=5%次氯酸钠消毒5min,灭菌水冲洗3次,无菌滤纸擦干。中菌丝块刺伤接种法和改良的保湿培养方法简单、快速而且准确有效,能够成功地用于检测和研究我国灰葡萄孢霉菌株的致病力分化。
3. 研究的基本内容与计划
2018.3.1-2018.3.15 提取dna、设计引物
2018.3.16-2018.5.16 建立lamp反应体系、对其检测结果特异性分析和灵敏度分析
2018.5.21-2018.6.6 整理数据、撰写论文
4. 研究创新点
首次将LAMP技术运用于灰葡萄孢菌的检测
LAMP技术检测的特异性强、灵敏度高，相较于PCR而言也大大缩短了检测时间。运用的检测设备也比较简单，操作也简便。
