1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
文 献 综 述
摘要：D-精氨酸( D-Arg) 是一种非蛋白质组成的氨基酸，是合成抗艾滋病药、心脑血管药、抗肿瘤药和减肥药等的重要中间体。精氨酸脱亚胺酶是一种具有重要应用前景的抗肿瘤酶类酶。精氨酸脱亚胺酶广泛分布于细菌、古细菌和少数低等真核生物中[5]。目前研究证实，精氨酸脱亚胺酶不但能抑制多种恶性肿瘤细胞的体外增殖，还能够抑制体内的恶性肿瘤增生，作为一种新型抗肿瘤物质已经受到越来越多研究者的重视[8]。本文结合国内外研究成果，综述了精氨酸脱亚胺酶的来源、性质、生理作用等研究领域的进展，旨在为精氨酸脱亚胺酶的研究与开发提供借鉴。
关键词：D-精氨酸；精氨酸脱亚胺酶；应用；制备
D-精氨酸( D-Arg) 是一种非蛋白质组成的氨基酸，是合成抗艾滋病药、心脑血管药、抗肿瘤药和减肥药等的重要中间体; 此外，D-Arg 的重要生理功能还表现在可抑制癌症扩散，治疗生长激素过多释放造成的紊乱及胰岛素抵抗等方面。D-Arg 在自然界中只有少量存在，目前D-Arg的制备方法主要有: ( 1) 化学法，通常工艺路线复杂，需先转化为氨基酸衍生物，步骤多、收率低、一般拆分率仅为50% 左右，且存在拆分剂的选择、回收及延长使用周期的问题[4]; ( 2) 生物转化法，刘钧忠等利用固定化精氨酸脱亚胺酶细胞的方法拆分DL-精氨酸( DL-Arg) 得到D-Arg 和L-瓜氨酸[6]; 刘毅等利用粪链球菌( Streptococcus faecalis) 精氨酸脱亚胺酶对L-精氨酸( L-Arg) 的专一脱亚胺作用，同时制备D-Arg 和L-瓜氨酸[7]。生物转化法反应条件温和，不产生有毒物质，转化体系中杂质较少，提取工艺简单。
精氨酸脱亚胺酶（Arginine Deiminase，EC3.5.3.6，简称ADI）是胍基修饰
超家族的一员，负责催化ADI途径中第一步反应，可将精氨酸转化为瓜氨酸和氨。ADI最早是由HORN F等于1933年发现于绿脓杆菌细胞中[1]。此后，人们在许多其他微生物细胞中，如粪链球菌、乳链球菌、梭状芽孢杆菌、酵母、微球菌、小球藻四膜虫、嗜盐菌和衣藻，特别是在支原体中，也发现了ADI的存在。但在高等真核细胞中目前还没有发现ADI。早前，ADI主要应用于转化精氨酸生产瓜氨酸。近年来，因其具有的成为精氨酸缺陷型肿瘤如肝细胞瘤、黑色素瘤抗癌药物的巨大潜力而被研究。美国食品药品管理局(FDA),欧洲药品审评署(EMEA)也将其作为罕见病药物用于治疗黑素瘤,肝细胞癌,是目前研究的一大热点[5]。
1. 精氨酸脱亚胺酶(ADI)的来源及性质
自从F.Horn于1933年首次报道绿脓假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)中含有ADI[7]以后,相继有多个报道称于假单胞菌,支原体,盐杆菌,乳球菌,原生动物等中发现ADI,源于不同种微生物的ADI性质比较见表1[5]。
表1不同来源微生物的ADI性质比较
来源 | 分子量/KDa | 酶活（Umg-1） | 最适pH | Km（mmolL-1） | 氨基酸相似度/% |
Pseudomonas putida | 120 | 58.8 | 6 | 0.2 | 96.4 |
Pseudomonas aeruginosa | 90 | / | 5.6 | / | 84.7 |
Lactococcus lactis | 140 | 140.3 | 7.2 | 8.7 | 31.6 |
Mycoplasma arginini[ | 90 | 44.5 | 6.5 | 0.2 | 27.1 |
Enterococcus faecalis NJ402 | 190 | 8.15 | 6.5 | 3.27 | / |
Pseudomonas plecoglossicida(WT) | 49 | 4.76 | 6 | 2.88 | 100 |
Pseudomonas plecoglossicida M314 | 49 | 21.7 | 6.5 | 0.43 | 99.3 |
由表1可知,不同微生物来源的ADI性质也不同, 6种不同ADI的分子量从49KDa-190KDa不等；比酶活范围从5.4-140.3U/mg；最适pH范围从5.6-7.6；其中来自Mycoplasmaarginini 和Pseudomonas plecoglossicida 的ADI氨基酸同源性只有27.1%。
2. 精氨酸脱亚胺酶的用途
2.1精氮酸脱亚胺酶具有成为抗癌药物潜力
氨基酸降解酶,如L-天冬酞胺酶因其降解天冬酸胺的作用而被用来治疗癌症[5]。
精氨酸对于人类而言是一种半非必需氨基酸。正常细胞可经尿素循环由精氨酸-琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酸-琥珀酸裂解酶(AL)催化瓜氨酸获得。如果肿瘤细胞生长需要精氨酸但不表达ASS,那么其生长就要依赖于外部环境提供精氨酸。已经证实,通过精氨酸降解酶精氨酸脱亚胺酶(ADI)降解精氨酸可抑制精氨酸缺陷型肿瘤(如黑素瘤以及肝细胞瘤)的生长,而对正常细胞的生长无影响[9,10]。
天冬酞胺酶是一种己经应用了20年的抗白血病药物,Gong等人发现,ADI能比天冬酞胺酶能更有效地抵抗白血病,仅仅需5-10ng/mL ADI就能抑制白血病细胞生长,比L-天冬酞胺酶的浓度低约20-100倍;并且ADI能够专一性地作用于T细胞,而不影响B细胞[32l，可以避免天冬酞胺酶的一些副作用,比如过敏性反应和凝固作用等[16]。有报道称ADI有抑制内皮细胞血管生成的作用[10]。而乳腺癌是一种依靠血管生成的疾病,因此通过ADI抑制血管的生成是一种很有希望的治疗乳腺癌的方法。
2006年,Kubo等人发现与HIV-1相关的CDS 细胞内毒素淋巴细胞(CTLS)上清中存在一种物质,可以抑制HIV-1病毒的复制。研究证实这种物质是ADI,推测ADI除了具有抗肿瘤的功能,还有潜在的抗病毒作用能力[11]。
2.2 精氨酸脱亚胺酶具有预防龋齿的作用
精氨酸分解代谢中,产生一定量的氨,这样可以有效地防止牙菌斑形成和蛀牙的产生。Streptococcus gordonii在牙齿表面的生物膜上较多地富集,S.gordonii ADI在防止龋齿中扮演重要角色[15]。
2.3 精氨酸脱亚胺酶可用于生产L-瓜氨酸
L-瓜氨酸是人体尿素循环的一个重要中间代谢物,具有很多功能,如血管舒张,稳定血压,治疗风湿关节炎、高血压、冠心病和男性性功能障碍等[12,13],应用前景广阔,因此瓜氨酸的生产有着重要的意义。工业上常采用发酵法和酶法来生产。其中酶法就是在ADI的作用下,将L-精氨酸转化为L-瓜氨酸的方法[14],目前L-精氨酸市场价格为75000元/吨,而其生产成本价在50000元/吨以内,瓜氨酸市场价为168000元/吨,国际市场上L-瓜氨酸年需求量在8000吨左右,其市场前景良好。
3．本实验研究内容与前景展望
本课题后利用基因工程技术从粪肠球菌（Enterococcus faecali）中扩增出精氨酸脱亚胺酶（ADI）基因片段，连接至pET-28a载体上，转化至BL21（DE3）感受态细胞中获得工程菌。利用工程菌中的精氨酸脱亚胺酶对DL-Arg进行酶法转化，获得高收率及高光学纯的D-Arg。
本课题利用生物转化法将DL-精氨酸转化成为D-精氨酸，具有反应条件温和，转化率高，提取工艺简单，光学纯度高等优点。作为一种环境友好型制备方法，将对D-精氨酸的生产产生革命性的影响。
4. 参考文献
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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案
研究的问题
一、利用基因工程技术从粪肠球菌（enterococcus faecali）中扩增出精氨酸脱亚胺酶（adi）基因片段，转化至感受态细胞中获得工程菌。
一、利用工程菌中的精氨酸脱亚胺酶对dl-arg进行酶法转化，通过发酵条件优化和
