1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
ε-聚赖氨酸（ε-poly-l-lysine，简称ε-pl）是日本的酒井平一和岛昭二两位博士1977年在大量筛选有价值的生物碱（dragendorff-positive）物质时首次发现的一种新型聚合物[1]。ε-pl是现在自然界仅发现的四种氨基酸同聚物之一，其具有广谱抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒的活性，且具有安全性能高、水溶性好、热稳定性好等优点，是一种性能优良的生物防腐剂。目前，日本、韩国、美国等国家已经批准其作为食品防腐剂进行应用。同时鉴于其聚阳离子性，水溶性好，热稳定性好，生物可降解等显著特点，ε-pl及其衍生物具有广阔的应用前景，除了食品防腐剂还被利用在食疗剂、生物可降解纤维、乳化剂、高吸水性凝胶、抗癌增效剂、药物载体及生物芯片包衣等行业。此外，ε-pl在化妆品、基因载体、药物包被物、电子材料和环保材料等领域也具有广阔的开发和应用前景[2]。相对于其巨大的市场需求，但目前世界上仅有日本实现了ε-pl工业化，ε-pl的生产还不能满足市场的需求，导致ε-pl市场价格居高不下，限制它的广泛应用。同时我国对于ε-pl研究也逐步从实验室阶段向工业化生产过渡。总之，ε-pl作为一种具有巨大的应用潜力与商业价值的生物高分子，已成为众多学者的研究热点。
日前工业上一般采用s.albulus作为ε-pl的发酵生产菌株，它是1981年由shimas和sakaih筛选得到并进行分类鉴定的。ε-pl发酵生产的影响因素很多，包括菌株、培养基、培养条件等均与ε-pl的生产密切相关，各国学者也对ε-pl的生产条件进行了深入的探究。1998年，日本学者通过筛选赖氨酸的结构类似物(s)-(2-氨乙基)-l-半胱氨酸(s-aec)的抗性菌株来遗传性地解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制,进而积累赖氨酸,再由聚赖氨酸聚合酶聚合,从而达到高产ε-pl的目的[3]。2006年台湾学者将s.albulusifo14147在发酵罐中进行批次补料发酵聚赖氨酸，通过控制两阶段的ph值和葡萄糖供给的控制产出高产量的ε-pl。第一阶段保持ph值为6.8培养48h，从而得到稳定的高密度细胞；第二阶段保持ph值为4.0，且当葡萄糖消耗后就不断添加以维持葡萄糖浓度为10g/l,从而增加了ε-pl的积累,同时也证明ph值的控制和葡萄糖的供给是增加聚赖氨酸的产量必不可少的[4]。guoliangwang等发现亚铁离子能够影响streptomycesdiastatochromogenescgmcc3145合成ε-pl。亚铁离子能够对代谢途径中主要的酶活和ε-pl生产中底物的消耗产生影响。当streptomycesdiastatochromogenescgmcc3145中加入0.1mm亚铁离子培养72h，能够发现ε-pl的产量和菌体量分别增加29.2％和41.9％，同时消耗的葡萄糖的量、氨氮的含量和磷的含量也分别增加50％、67.6％和35.7％。而且通过酶活显示出蛋白酶、磷酸酶、谷氨酸脱氢酶以及天冬氨酸转氨酶的活性都有所增加。所以添加亚铁离子能够通过提高天冬氨酸盐产物进一步催化产生更多供ε-pl合成的赖氨酸前提，从而提高ε-pl的产量[5]。张扬等通过固定化的方法，通过丝瓜瓤固定kitasatosporasp.my5-36的菌丝体，从而使得单位体积的菌丝体量提升，最终ε-pl的发酵液中含量达到了34.11g/l，同时利用固定在丝瓜瓤上的菌丝体作为下一批次发酵的种子进行重复批次发酵大大提高了发酵的效率，节约了发酵时间和成本[6]。junxia等人从s.albuluspd-1生产ε-pl的发酵液中纯化得到聚二氨基丙酸（pdap），pdap是一种新颖的非蛋白氨基酸低聚物，并且能够很好的抑制酵母的活力。同时junxia等人发现在s.albuluspd-1发酵时，向培养基中添加柠檬酸培养时能够抑制pdap的产生，从而增加ε-pl的产量[7]。总之通过对菌种的筛选、诱变以及发酵条件的优化，现在ε-pl的生产水平已经有了很大程度的提高。但是这些实验大部分都集中在ε-pl的发酵调控，而对ε-pl的合成机制研究很少涉及。
2008年yamanaka等首次报道了pls的纯化和性质表征工作[8]，结果表明s.albulusnbrc14147来源的pls是一个二聚体膜蛋白，带有六个tm结构域。对pls编码基因的氨基酸序列分析发现，pls由负责l-赖氨酸腺苷化的a-domain、负责巯基化的t-domain和负责赖氨酸缩合的c-domain构成；在合成初始，l-赖氨酸单体被先后腺苷化和巯基化，而后在c-domain与另一活化后的单体缩合，形成二聚体；该过程循环进行，最终导致ε-pl的链长增加。因此，c-domain被推测是负责调控ε-pl聚合度的结构域，进一步的分析发现c-domain由三个亚基c1-domain、c2-domain、c3-domain构成。但三个亚基如何协同作用控制ε-pl聚合度仍不清楚，因而该猜想尚未得到证实。基于该研究，jan在《nature》杂志上撰文认为，微生物是通过pls酶合成ε-pl的，这是一种非核糖体合成途径(nprs)，自此ε-pl的合成机制研究进入了一个全新的阶段[9]。ε-pl聚合度的调控与pls密切相关。然而常见的nprs系统需要一个硫酯酶结构域(te-domain)来终止产物延伸[10,11]，达到调控产物聚合度的目的；而pls是发现的首例不含有这一结构的nprs系统，那么pls是如何调控ε-pl聚合度的研究这一新颖的问题具有重要的学术价值和科学前沿性。
2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案
本课题组在前期工作中筛选到两株高产ε-PL的放线菌，分别鉴定命名为StreptomycesalbulusPD-1和Kitasatosporasp.PL6-3，这两株菌株均可在发酵过程中高效合成ε-PL，但在聚合度上存在显著差异。其中S.albulusPD-1所产ε-PL的分子量为3.5-5.0kDa，聚合度为25-35；而K.spPL6-3所产ε-PL的分子量约为1.3-2.5kDa，聚合度为10-20。本课题希望对两株ε-PL的菌株的Pls进行研究，对其合成Pls的合成机制进行补充，对Pls如何调控合成不同分子量的ε-PL机制进行研究。但是首要条件需要对Pls的表达体系进行建立，进而能够通过pls基因的表达、Pls的纯化及突变进行Pls合成机制的解析。故本课题的研究内容为Pls在模式链霉菌S.lividansTK24中异源表达体系的研究。
