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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 世界人口的急剧增长和生态环境的持续恶化导致了可用耕地面积的已经捉襟见肘，粮食问题成了各国首要解决的难题。农药对于预防和防治病虫草害、保证粮食品质和增加粮食产量等方面具有十分重要的作用。通过半个多世纪的不懈努力与探索，化学农药的开发与大面积推广应用已取得了长足的发展。虽然有害生物种群的演替变迁以及抗药性的产生和迅速发展，化学农药面临新的挑战，但化学农药依然是控制有害生物的主要手段之一。但是传统农药对环境危害很大，随着人们对生态环境保护意识的加强和对化学农药污染、农药对非靶标生物的影响以及在农药生态环境中归宿问题的重视，对新型绿色农药的呼声越来越高。因此，开发低毒、高效、环境友好型的新农药成为了现在农药开发的主要任务[1]。 含氮杂环化合物通常具有独特的生物活性、低毒性和高内吸性，常被用作农药和医药的结构单元。含氮杂环化合物由于其生物活性广、作用位点丰富等特点在农药的研究开发中占有重要的地位[2-8]。喹唑啉-4(3H)-酮是喹唑啉酮的重要类型，其主体为一个含苯并氮杂六元稠杂环，其衍生物同样具有着诸多的生物活性，在医药与农药等领域有着广泛的应用。如杀菌剂氟喹唑 (fluquinconazole)、抗寄生虫药常山酮 (Halofuginone)、抗癌药物诺拉曲特(nolatrexed)以及镇静药物安眠酮 (metHaqualone)等。此外，在天然产物中分离提取的生物碱中，大约有200种化合物含有喹唑啉-4(3H)-酮的小分子结构。由于其广谱的生物活性以及结构互变的特点，喹唑啉-4(3H)-酮类化合物已经成为有机化学和药物化学领域的研究热点之一。 吡啶盐作为两亲性分子，包含亲水部分和疏水部分，其亲疏水两部分一般通过共价键而连接，具有化学稳定性好，耐热，耐光，耐强酸，耐强碱，且有优良的渗透、乳化、抗静电等性能。基于吡啶盐的两亲性分子可以通过非共价键的相互作用形成超两亲性分子（superampHipHile），其自组装形成的不同尺寸和形貌的聚集体在农药等生物活性小分子的传输及可控释放方面具有潜在的应用前景[9-16]。因此，设计合成含吡啶盐基团的两亲性分子，研究其生物活性及作用机制，同时研究其自组装特性，寻找在农药等生物活性小分子的传输及可控释放上有潜在应用的组装体，具有重要的现实意义。 由上文介绍可知，喹唑啉酮类化合物及喹唑啉酮类衍生物具有良好广谱的生物及其生理活性。并且其具有分子骨架小，结构简单，修饰性强，对无病变组织的毒性小等特点，被修饰后的喹唑啉酮化合物的生物活性方面会大大提高，从而赋予了喹唑啉酮类化合物很高的研究价值。所以我们将吡啶盐加入到喹唑啉-4(3H)-酮上，使其同时具有吡啶盐的化学稳定性好，耐热，耐光，耐强酸，耐强碱，有优良的渗透、抗静电等性能，其合成简单、成本低廉等特点，打破物细胞膜本有的防御机制，获得广谱的生物活性。 本文在查阅相关文献的基础上，结合上述分析，喹唑啉-4(3H)-酮类化合物具有良好的生物活性，可作为农药开发的先导化合物。使其与吡啶反应可得到的吡啶盐结构的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物，采用薄层色谱、重结晶、柱色谱等方法对合成的化合物进行纯化；用核磁共振仪、数字熔点仪、红外光谱仪等对合成的化合物进行结构鉴定。期望从中筛选出具有较高生物活性的吡啶盐结构的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物，为研发新型绿色杀菌剂提供初步依据。 参考文献： [1] [1] 张一宾, 张怿. 世界农药新进展 [M]. 北京: 化学工业出版社, 2006. [2] [2] 王翔. 新型喹唑啉酮衍生物的设计、合成及生物活性研究 [D]. 贵阳: 贵州大学, 2014. [3] [3] 张婷. 苯并咪唑类化合物的合成、结构表征及其生物活性 [D]. 大连: 辽宁师范大学, 2011. [4] [4] 戴红. 新型氮杂环类化合物的分子设计、合成及生物活性研究 [D]. 天津: 南开大学, 2009 [5] [5] 李晶. 新型咪唑类衍生物的合成与杀菌活性研究 [D]. 武汉: 华中师范大学, 2007. [6] [6] 陈书哲. 含氮杂环化合物的合成及生物活性研究 [D]. 西安: 西北大学, 2008. [7] [7] 宋倩. 含氮杂环衍生物的合成及生物活性研究 [D]. 北京: 中国农业科学院,2009. [8] [8]宁国慧. 3,5-二取代的异噁唑啉类衍生物的合成及杀菌活性研究 [D]. 天津: 天津大学, 2014. [9] [9] SangeetHa, N. M.; Maitra, U.Supramolecular gels: functions and uses [J]. CHem. Soc. Rev.2005, 34,821-836. [10] [10] Piepenbrock, M. O. M.; Lloyd,G. O.; Clarke, N.; Steed, J. W. Metal- and anion-bindingsupramolec-ular gels[J]. CHem. Rev. 2010, 110, 1960-2004. [11] [11] Gamsey, S.; Miller, A.; Olmstead, M. M.; Beavers, C. M.; Hirayama,L. C.; PradHan, S.;Wessling, R. A.; Singaram, B. Boronic acid-basedbipyridinium salts as tunable receptors formonosaccHarides and alpHa- Hydroxycarboxylates[J]. J. Am. CHem. Soc. 2007, 129,1278-1286. [12] [12] Yu, G.; Ma, Y.; Han, C.; Yao, Y.; Tang, G.; Mao, Z.; Gao, C.; Huang,F. Asugar-functionalized ampHipHilic pillar[5]arene: syntHesis, self-assemblyin water, and application in bacterial cell agglutination [J]. J. Am. CHem.Soc. 2013, 135, 10310-10313. [13] [13] Rosler, A.; Vandermeulen, G. W. M.; Klok, H. A. Advanced drugdelivery devices viaself-assembly of ampHipHilic block copolymers [J]. Adv.Drug Delivery Rev. 2001, 53, 95-108. [14][14]Moon, H. J.; Ko, D. Y.; Park, M. H.; Joo, M. K.; Jeong, B.Temperature-responsive compounds as in situ gelling biomedical materials [J].CHem. Soc. Rev. 2012, 41, 4860-4883. [15] [15]Wan, L. J. Fabricating and controlling molecular self-organizationat solid surfaces: studies by scanning tunneling microscopy [J]. Acc. CHem.Res. 2006, 39, 334-342. |
2. 研究的基本内容和问题
| 一、研究的目标 为了开发具有显著杀菌活性的新型绿色农药，本项目拟设计合成结构中含吡啶盐的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物，并对其结构进行结构表征和杀菌活性测定，期望筛选具有较高生物活性的含吡啶盐结构的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物。 二、研究的内容 1、含吡啶盐结构的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的合成 拟先利用取代的邻氨基苯甲酸甲酯合环生成喹唑啉-4(3H)-酮类化合物，而后与1,2-二溴乙基反应，合成中间体3-溴乙基喹唑啉-4(3H)-酮类化合物，最后和吡啶反应即生成含吡啶盐结构的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物。 2、含吡啶盐结构的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的结构表征 采用薄层色谱、重结晶、柱色谱等方法对合成的化合物进行纯化；然后采用核磁共振仪、数字熔点仪、红外光谱仪等分析方法对合成的目标化合物进行结构表征。 3、含吡啶盐结构的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的杀菌活性测定 拟用三种细菌：水稻白叶枯病菌、柑橘溃疡病菌、水稻条纹病菌和三种真菌：水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、草莓灰霉病菌作为供试病原菌对4个目标化合物进行室内杀菌活性的筛选。 三、拟解决的关键问题 1、摸索中间体3-溴乙基喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的合成方法并成功分离出目标产物是关键问题之一； 2、目标分子的生物活性尚无公开报道，正确评价它们的生物活性也是关键问题之一。 |
3. 研究的方法与方案
| 一、合成路线 1、喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的合成
图1 2、中间体3-溴乙基喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的合成
图2 3、含吡啶盐结构的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的合成
图3 上式中，R: H; 8-Me; 6-Cl; 7-di-OMe
二、实验方案 1、合成方法 （1）喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的合成 于100 mL的三颈烧瓶中依次加入含取代基的邻氨基苯甲酸甲酯 (0.1 mol)、甲酸 (0.5mol)和甲酰胺 (65 mL)，加热至130–140 oC，回流反应4–5 h，趁热将其转移至500mL的冷水中，搅拌约30 min后，抽滤即得中间体2，放入烘箱烘干，称重。 （2）3-溴乙基喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的合成 于100 mL的三颈烧瓶中依次加入中间体2 (0.02 mol)、1,2-二溴乙烷 (0.04 mol)、碳酸钾 (0.06 mol) 和丙酮 (75 mL)，加热回流。待反应完成后，将其转移至100 mL的冷水中，搅拌约30min后，抽滤，柱层析分离，即得中间体3。 （3）含吡啶盐结构的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的合成 于50 mL的三颈烧瓶中依次加入中间体3 (0.5 g)和吡啶 (20mL)，加热至70–80 oC，反应约3 H后产生大量白色固体。抽滤，二氯甲烷淋洗，即得目标化合物4。 2、目标化合物的结构表征 采用薄层色谱、重结晶、柱色谱等方法对合成的化合物进行纯化，干燥，测定其熔点，采用IR、1H-NMR等分析方法对合成的化合物进行结构鉴定。 3、目标化合物生物活性研究 本次试验以三种细菌：水稻白叶枯病菌、柑橘溃疡病菌、水稻条纹病菌作为供试病原菌用菌丝生长速率法对4个目标化合物进行室内杀菌活性测定；再以三种真菌：水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、草莓灰霉病菌作为供试病原菌用浊度法对4个目标化合物进行室内杀菌活性的筛选。 （1） 菌丝生长速率法 培养基：PDA培养基 (马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基)。制备过程为：将新鲜的土豆（削皮、除去芽眼），加蒸馏水煮化，过滤收集滤液，向其中加入葡萄糖和琼脂，搅拌使其均匀。最后倒入的锥形瓶中，进行高压灭菌操作。 菌丝活化：在凝固的PDA培养基的中央接种病菌菌体，于25℃生化培养箱中培养，当菌体生长直径超过培养皿半径后即可使用。 含药平板制备：用甲醇溶解目标化合物，制成母液。然后将其加入已灭菌的PDA培养基中，制成10mg/L含药培养基。每个药剂设置3个平行，同时，设立空白对照。 菌饼接种：将已经活化好的菌饼（直径为0.5 cm）用接种针放置在含药培养皿中央，菌丝朝上，将培养皿倒置于25 ℃培养箱中培养。 调查方法：当对照培养基上的菌落直径达到培养皿2/3以上时，用十字交叉法测量菌丝直径(cm)，多次测量取平均值，计算药剂对菌体生长的抑制率，计算公式如下：
（2） 浊度法 培养基：NA培养基。制备过程为：将葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和琼脂依次加入到超纯水中，待全部溶解后用氢氧化钠调节pH约为7。用5 mL的移液枪转移4 mL上述培养基于15mL的试管中，橡皮筛密封后，进行高压灭菌。 细菌活化：将刚从灭菌锅中拿出的NA培养基（趁热）分批倒入培养皿中，开紫外灯，灭菌半小时（同时等NA培养基冷却凝固）。用接菌环接触病原菌单菌，然后以划线的方式将其接到已冷却的培养基上。用封口胶封好培养皿口，将其放入28℃的恒温培养箱中培养，直到长出单菌落（大概2-3天细菌就可以长好）。将其放入4℃的冰箱中保存。 细菌的培养：用接菌环（冷却）划一小块含有菌的培养基放入含有无菌培养基的锥形瓶中。塞好塞子，在28 oC、180 rpm恒温摇床振荡培养到生长对数期（OD=0.6~0.8）备用。 调查方法：将空白96孔板放入仪器中，在595nm处测试空白OD值。校正OD值和抑制率的计算公式如下： 校正OD值=含菌培养基OD值－无菌培养基OD值
三、可行性分析 1、Alexandre、刘志红、杨绪红等人设计合成了具有抑菌活性的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物，王培义等人详细介绍了关于吡啶盐的两亲性分子的设计合成、生物活性及其功能化研究。基于以上文献，将吡啶盐结构引入喹唑啉-4(3H)-酮的骨架上开发出可能具有良好生物活性的有机分子有良好的实验基础。因此可以认为，本课题采用的合成路线和方法科学、可行。 2、指导教师的研究室具备本试验中所使用的各类仪器设备。有旋转蒸发仪、集热式磁力加热搅拌器、数字熔点仪、紫外光谱仪、核磁共振仪、红外光谱仪、智能型光照培养箱、电热蒸汽消毒器等仪器设备。另外，还有各种供试验用的玻璃仪器。具备的实验条件能够满足本项目合成、结构表征及生物活性测定的需要。 3、指导教师杨春龙教授长期从事与本项目有关的的研究工作，先后主持多项国家级及省级科研项目，有丰富的研究经验及指导能力。本课题申请人修读了包括实验课程在内所有化学类基础课程，具有较强的专业基础，而且主持过校级SRT项目，具备一定的科研能力。 综上所述，本项目一定能按照计划完成预期目标及研究内容。 |
4. 研究创新点
| 喹唑啉-4(3H)-酮类化合物在抗肿瘤、抗菌、除草、杀虫等多方面具有显著生物活性，作为农药合成的先导化合物有其独特的优势。在农药分子中引入该结构不仅能够提高农药理化性质，还能提高其生物活性，扩大生物活性谱。含有吡啶基团的化合物因其具有良好的生物活性，作为两亲性分子，包含亲水部分和疏水部分，其亲疏水两部分一般通过共价键而连接，具有化学稳定性好，耐热，耐光，耐强酸，耐强碱，且有优良的渗透、乳化、抗静电等性能。本文依据活性基团拼接原理，将吡啶盐引入到喹唑啉-4(3H)-酮的骨架中，设计合成的目标化合物结构新颖，可能具有良好的杀菌活性。 |
5. 研究计划与进展
| 2019年6月前完成4-10个含吡啶盐结构的喹唑啉-4(3H)-酮类化合物的合成与生物活性研究。 研究工作分为三个阶段： 1、从2018年12月到2019年2月 （1）查阅相关文献； （2）设计实验方案。 2、从2018年2月到2018年4月 （1）合成目标产物； （2）鉴定产物结构； （3）测定目标产物的生物活性。 3、2018年6月 （1）撰写论文； （2）进行毕业答辩。 |
