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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
白鹤芋（spathiphyllum floribundum）又名白掌、银苞芋、一帆风顺，属天南星科白鹤芋属多年生草本植物。原产南美热带雨林地区，喜高温多湿和半荫环境。其翠绿的叶片，洁白的佛焰苞，清新优雅，是世界重要的室内观叶观花植物，还是过滤室内废气的能手，对nh3、丙酮、苯和甲醛都有一定清洁的功效，且耐阴性强，还可以用作切花，深受人们欢迎而被广泛种植。
随着人们生活水平的不断提高，绿色植物装饰室内环境，不仅起到美化作用，还可调节室内小环境，因而广受欢迎。白鹤芋是众多观叶植物中较为突出的一种，栽培应用很广，目前，对其研究主要集中在组织培养、植物生长调节剂诱导及杂交育种方面，关于花色转基因的报道较少。[1-2]
花青素又称花色素，是一类广泛存在于植物细胞液泡中的水溶性色素，属类黄酮化合物，是一类植物次生代谢产物。花青素是构成果实颜色和各种花瓣的主要色素之一。[3]此外，花青素还具有抗衰老、抗氧化、抗动脉硬化等作用，是目前发现的最强的自由基清除剂。自然界中主要有6类花色素，即天竺葵色素(pelargonidin)、芍药花色素(peonidin)、矢车菊素(cyanidin)、牵牛花色素(petunidin)、飞燕草色素(delphinidin)和锦葵花色素(malvidin)，其生物合成和调控已有较深入的研究。花青素生物合成途径的前体物质是4－香豆酰coa与3－丙二酰coa，最后形成花的颜色涉及的一系列酶有:查尔酮合酶(chs)、查尔酮异构酶(chi)，黄烷酮3－羟化酶(f3h)、二氢黄酮醇4－还原酶(dfr)、花色素合成酶(ans)和udp－葡萄糖类黄酮－3－o－葡萄糖基转移酶(ufgt)等。[4-5]
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标：
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利用dfr基因转化白鹤芋获得转基因植株；
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明确转基因植株dfr基因的表达特征及花青素积累特征。
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研究方法和实验方案：
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白鹤芋转化材料的培养
MS 6-BA 3mg/L NAA0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH 5.7，灭菌后分装到培养皿中。将白鹤芋叶柄切成0.5cm片段，接种于培养基上，暗培养。
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农杆菌活化
挑取携带有DFR基因的农杆菌单菌落，接种于YEB液体培养基上，划线培养，避光倒置于28℃恒温摇床培养2天，用于白鹤芋叶柄的侵染和共培养。
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挑单菌落
60mLYEB液体培养基，加入60μL kana，60μL Rif，用枪头挑出单菌落打入培养基中，在28℃、200rpm/min的恒温摇床上培养1天。
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DFR基因对白鹤芋的遗传转化：
测OD600值为1.2左右，倒入离心管，4000rpm/min,10min，离心后倒掉上清液,加MS液体培养基，振荡使菌液悬浮，倒入三角瓶，测OD600为0.5左右，加AS 100μM/L。准备两个镊子，叶柄夹入菌液，手摇10min，夹出置于滤纸上，待表面稍干，用另一个镊子夹入培养皿中，暗环境下培养3天。3天后转入抑菌培养基（MS TDZ 0.5mg/L 2.4-D 1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH 5.7，特美汀200mg/L，潮霉素20mg/L）进行筛选。
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抗性植株筛选和PCR鉴定：
接种于选择培养基上的叶柄生长40-60d后，抗性叶柄转为绿色，非抗性叶柄白化或褐化死亡。将抗性叶柄转移至生长培养基，促进叶柄进一步生长和分化。
切取转化植株幼嫩叶片，CTAB法提取DNA，按照选择标记基因设计引物进行扩增，检测抗性植株是否为转基因植株。
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转基因植株的增殖和生根培养：
筛选和鉴定的转化阳性植株接种于增殖培养基进一步增殖，增殖后进行生根培养，获得完整生根植株。
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转基因植株花青素含量测定及DFR基因的表达分析：
生根的白鹤芋转基因植株生长至3片叶后，移栽至光照培养箱，生长30d后进行花青素含量测定，以未转化植株作为对照，同时提取RNA，反转录成cDNA后，通过PCR扩增检测DFR基因的表达水平。确定所筛选株系花青素积累与所转基因表达水平的相关性。
技术路线：
图1 DFR基因对白鹤芋的遗传转化及转基因花青素积累特征研究技术路线
可行性分析：
申请人所在实验室具有一定数量的白鹤芋材料，目前生长良好，可以用于本试验；此外，实验室开展热带兰组织培养研究多年，已开展花色相关基因克隆等工作，克隆了AaDFR和ChCHS等花色相关基因，预期在1年左右时间可以建立较为完善的转基因系统，并获得转基因植株。
4. 研究创新点
本研究拟通过异源转化DFR基因改良白鹤芋花色，对于培育新型花色的白鹤芋新品种具有重要的应用价值。利用DFR基因转化白鹤芋可以克服自身DFR基因表达较弱的问题，DFR基因在白鹤芋中预期能正常表达，可以克服常规杂交育种方法不能改良该性状的问题。
5. 研究计划与进展
2018年9月-12月：dfr基因对白鹤芋叶柄转化；
2019年1月-2月：抗性植株筛选；
2019年3月-4月：转基因植株培养及增殖；
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