1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
丙酮酸激酶在肿瘤细胞代谢及生长中起着至关重要的作用。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，pk）是催化糖酵解最后一步反应的关键酶。它在人体内存在四种同工酶：l、r、m1和m2型，l、r、m1型的表达各有其组织特异性，m2型（即pkm2）特异高表达于胚胎及成体干细胞，随着胚胎发育逐渐被其他同工酶代替，但在肿瘤发生过程中pkm2表达上升并取代其他同工酶，如肝癌中pkl消失，而pkm2大量表达[1]。
pkm2是肿瘤代谢领域的热点之一。结合最近三年的文献，我们发现pkm2被多种复杂的机制调控，通过改变表达量或酶活在多个层面调节肿瘤细胞代谢和生长：（1）pkm2的表达受多种转录因子调控：被脯氨酰羟化酶（phd）羟基化后与缺氧诱导因子1α（hif1α）结合，将p300募集到pkm2启动子区，增强hif1α转录活性，进一步增强pkm2的表达[2]；（2）pkm2的丙酮酸激酶活性受代谢中间产物调控：fbp是pkm2构象转换的重要调节因子[3-5]；（3）pkm2的丙酮酸激酶活性受外界环境和蛋白质翻译后修饰调控：磷酸化是pkm2的一种重要修饰手段，成纤维细胞生长因子受体1（fgfr1）可促使pkm2第105位酪氨酸磷酸化，消除fbp对pkm2的变构效应[6]；（4）pkm2具有蛋白激酶活性并受到表皮生长因子受体（egfr）和fgfr1等调控，pkm2依赖的组蛋白h3第11位苏氨酸的磷酸化对egfr促进的细胞增殖和肿瘤生长是必须的[7]；吕等人的研究显示：高浓度葡萄糖可促使pkm2第305位赖氨酸乙酰化，抑制pkm2酶活并促使其通过自噬途径被降解；pkm2乙酰化可促使肿瘤细胞内糖酵解中间产物累积，促进肿瘤生长[4]；pkm2的第433位赖氨酸位点乙酰化可被有丝分裂和原癌基因调控，乙酰化干扰了pkm2与fbp结合并促使pkm2入核，增强其蛋白激酶活性[5]；
pkm2的两种构象具有不同的酶活性，它在细胞质中主要以四聚体存在，具有高丙酮酸激酶活性；特别重要的是我所在研究组和国际上其他研究组都发现二聚体的pkm2可以入核，具有高蛋白激酶活性。中间代谢产物和蛋白质翻译后修饰等细胞内外因素调控pkm2构象转换，使肿瘤细胞根据不同需要在产生能量和合成生物大分子之间快速转换，有效维持肿瘤能量和合成原料供应的平衡，这极大地增强了肿瘤细胞对环境的适应力。但是pkm2复杂的分子调控机制尚有很多空白，如：（1）除了磷酸化和乙酰化外，pkm2上还有别的翻译后修饰存在吗？（2）这些新的翻译后修饰是否可以调控pkm2的丙酮酸激酶活性和蛋白激酶活性？（3）如果可以，通过何种机制调控酶活？（4）对肿瘤细胞代谢和生长有何功能？
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
研究pkm2的乙酰化、泛素化和磷酸化等蛋白质翻译后修饰间交互应答的方式，为阐明其调节细胞能量代谢和生长的机制，及为丰富其对肿瘤细胞生长调控机理的认识提供依据。
研究内容
3. 研究的方法与方案
研究方法
质粒构建，Western Blotting，免疫沉淀，色谱分离和质谱鉴定等。
技术路线
细胞转染 |
免疫沉淀 |
胶内酶解 |
质谱鉴定 |
搜库 |
实验方案
1.PKM2质粒构建
先PCR扩增，PCR产物琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。对载体和PCR产物分别进行双酶切，切胶回收后，连接酶连接，转化大肠杆菌，37℃培养过夜，挑取单菌落进行菌落PCR，选取阳性克隆测序，测序正确的质粒用大肠杆菌进行扩增。
2.细胞培养
a.复苏b.传代c.冻存
3.蛋白收集
a.细胞裂解b.样品处理
4.Bradford法测蛋白含量
5.Western Blotting
a.SDS-PAGE电泳分离b.转膜c.封闭d.抗体孵育e.化学发光检测
6.细胞转染
7.免疫沉淀
a.裂解细胞b. FLAG-Beads的预洗c.免疫沉淀
8.考染
考马斯亮蓝染色，室温3-4h，再进行脱色
9.胶内酶解
a.切胶b.脱色c.洗涤d.干胶e.挥发f.酶解g.萃取两次h.真空离心干燥
10.色谱分离和质谱鉴定
11.质谱数据检索
可行性分析
本人所在实验室承担过多项国家级重大课题，蛋白质翻译后修饰研究方面所需各种实验技术平台也已完善。细胞培养、免疫沉淀、细胞与分子生物学实验均是本实验室成熟的技术。
4. 研究创新点
首次发现在肿瘤细胞代谢和生长中有重要作用的PKM2被琥珀酰化，本课题研究肿瘤细胞在响应外界刺激时，PKM2乙酰化、泛素化和磷酸化等翻译后修饰间交互应答规律，对PKM2丙酮酸激酶活性和蛋白激酶活性的平衡以促进肿瘤生长的机制。该课题多学科、多技术交叉融合（蛋白质组学、肿瘤细胞生物学、分子生物学、肿瘤病理学等），从分子、细胞和个体水平开展整合性研究，为揭示PKM2促进肿瘤生长的分子机制以及从翻译后修饰角度提出可能的干预治疗手段奠定基础，有着重要的科学意义和应用价值。
5. 研究计划与进展
2月15日-3月1日 熟练实验操作以及仪器使用
3月2日-3月20日 构建质粒pkm2
3月21日-3月31日 对所构建的pkm2的质粒表达效果进行检测，摸索转染条件。
