1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义
每年数以百万计的患者死于癌症。microrna是生物体内一类发挥重要作用的小分子rna。它在细胞分化，个体发育以及疾病的发生中具有着重大作用。虽然，目前人类已经发现了大量的microrna，但是对其生物功能尚未透彻了解。本课题以癌细胞为作用对象，利用crispr-cas9技术构建mir-210基因敲除细胞模型，为后期研究mir-210基因的功能提供材料。
mirnas是一类在多细胞生物中广泛表达、大小为22个核苷酸(nucleotide,nt)左右的非编码rnas(1,2)。mirna分子与argonaute(ago)蛋白形成一个复合体，然后结合靶基因mrna位于3非编码区的部分互补序列，从而降低靶基因的蛋白质翻译水平和/或mrna表达水平(1,3)。mirnas调控各种各样的生物过程,并且和人的疾病如癌症密切相关(2,4-6)。例如，let-7家族的mirnas的表达在肺癌中下降，且let-7家族mirnas被证明具有肿瘤抑制功能(7-9)，而mir-17-92簇mirnas具有致癌功能，其表达在多种癌症中上升(10-13)。因此，研究mirna系统、通路及其作用机理对癌症的诊断、预后、治疗有重要的意义。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
（1）利用crispr/cas9获得mir-210基因敲除癌症细胞系。
（2）验证crispr/cas9基因敲除效率。
3. 研究的方法与方案
研究方法
1.设计针对mir-210的sgrna，构建crispr-cas9载体
crispr-cas9技术的关键步骤是设计恰当的sgrna。cas9识别一短dna序列5-ngg-3，而20ntrna的向导序列就紧靠在它的5。因此，要突变的基因位点必须有此序列：5-n20-ngg-3。按照这一原则，我们将设计mir-210的sgrna，构建质粒载体表达sgrna和cas9。另外，载体中还同时表达gfp（greenfluorescenceprotein，绿色荧光蛋白)或/和嘌呤霉素抗性基因，以助于筛选稳定转染的细胞系及细胞的体内观察。
4. 研究创新点
特色或创新之处
本课题原创性强，设计充分考虑到申请项目的经费规模,研究思路和步骤简炼,但意义重大。采用最新的CRISPR/Cas9基因剪辑技术,在人的癌细胞内高效地突变miR-210基因，构建基因突变的细胞模型，这样可以节约大量的时间、人力、物力、财力。因此，我们可以在最短时间内对miRNA及癌症同时进行深入的基础研究，并获得成果，填补目前世界上对miR-210在癌领域研究中的空白，并为未来的工作提供新的实验模型和理论依据。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
1.2016年2月-2016年3月：利用生物信息学软件，寻找靶基因，设计引物；
2.2016年3月-2016年4月：构建sgrna重组质粒和cas9体外表达载体；同时获取稳定传代的细胞；
