1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
现如今，肿瘤已成为医学界的关注焦点，在人类的死亡原因中排名第二，仅2015年一年就引起了880万人死亡[1]。此外，肿瘤在动物上也同样是一种高发性疾病，严重影响动物的生活质量与寿命。作为国内犬第二大肿瘤的乳腺肿瘤，其发病率约占全部犬肿瘤病例的30%[2]。在人医上，中国虽不是乳腺癌的高发国家，但依旧拥有十万分之四十二左右的发病率。因此，不论是在人类或是动物的医学领域，肿瘤疾病均受到了人们的高度关注。
影响肿瘤的因素有很多，不仅我们所处的环境与药物的预防治疗对肿瘤疾病产生影响，饮食因素也与肿瘤的发生发展存在着重要的相关性[3]。而姜在我们的饮食生活中已成为了人们不可或缺的调味品之一，有解表散寒，温中止呕等功效[4]，其根茎也拥有广泛的药用功效。姜酚存在于姜的根茎之中，是一种味辣而苦的酚类物质，具有抗氧化、抗诱变、抗炎、抗风湿[5]等多种生物活性。目前，在人医领域中，已有多项研究表明姜酚在抗肿瘤中也有一定的作用。早在1998年国外就有研究表明6-姜酚对hl-60细胞（即人早幼粒白血病细胞）有抑制作用，提出了姜酚作为抗肿瘤药物的潜力作用[6]。在之后的几年中，又有多项研究揭示了6-姜酚的抗肿瘤作用机制，如2006年发表的对6-姜酚诱导表达突变型p53的胰腺癌细胞的细胞周期停滞和细胞死亡相关研究[7]。再如2007年发表的6-姜酚抑制mda-mb-231人乳腺癌细胞的转移相关研究[8]，从姜酚对肿瘤细胞的黏附侵袭与运动的抑制角度进行了研究等等。直到2009年，首次提出10-姜酚对人直肠癌细胞的抑制作用机制研究[9]，并相继对10-姜酚的抗肿瘤作用机制有了更多的研究。8-姜酚的研究则主要集中在2015年之后，且相关研究并不是很多。而国内的相关研究相比之下则比较少，且研究较晚。然而不论是6-姜酚，10-姜酚还是8-姜酚目前均已有研究表明对人乳腺肿瘤细胞有抑制作用[10][11][12]，且已有一些抑制机制已被发现。
然而目前姜酚对动物肿瘤的抑制作用却几乎没有研究，因此结合国内乳腺肿瘤在犬上的高发情况，本课题主要研究6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚三种主要姜酚成分对犬乳腺肿瘤细胞的抑制作用，这可能是首次将姜酚作用于动物肿瘤细胞，该研究很可能能够为犬的抗肿瘤药物研发提供帮助，提供一种新的动物抗肿瘤方法，以减少其它已有抗肿瘤方案的毒副作用，为犬乳腺肿瘤治愈率的提升方法提供一种新的思路。
2. 研究的基本内容和问题
本课题主要通过研究姜酚对犬乳腺肿瘤细胞cipp的抑制作用提供一种新型犬用抗肿瘤药物的可能性。
在本课题中将会对6-姜酚，8-姜酚和10-姜酚三种不同的姜酚成份对犬乳腺肿瘤细胞cipp的细胞活性，迁移能力和侵袭能力等进行具体研究，并将三种药物对肿瘤细胞的抑制能力进行对比，已求解决“三种姜酚成分是否都会对犬乳腺肿瘤细胞的细胞活性产生抑制作用？半数致死量分别是多少？”“三种不同姜酚成份是否对犬乳腺肿瘤细胞的迁移能力都有一定的影响？”“三种不同姜酚成份是否对犬乳腺肿瘤细胞的侵袭能力都有一定的影响？”“三种姜酚成份中的哪个成份对犬乳腺肿瘤细胞的抑制作用最强，最有潜力成为新的抗肿瘤药物？”等关键问题。
本研究的目标旨在能够通过研究姜酚对犬乳腺肿瘤细胞的细胞活性和迁移侵袭的抑制作用初步揭示以姜酚成份为主的中药对犬乳腺肿瘤细胞的细胞活性作用效果，对犬肿瘤细胞的迁移侵袭运动作用效果，对比不同药物的作用效果从而筛选出最佳药物以为后续进一步深入研究其药物的作用和机制奠定基础，更是初步筛选出三种药物成份中最有潜力的姜酚成份，为抗肿瘤药物研发提供帮助。
3. 研究的方法与方案
本课题选择6-姜酚，8-姜酚与10-姜酚分别作用于犬乳腺肿瘤细胞cipp，通过cck细胞活性检测试验检测其对犬乳腺肿瘤细胞细胞活性的抑制作用，通过细胞划痕修复试验检测其对犬乳腺肿瘤细胞的迁移能力的抑制作用，通过transwell试验检测细胞侵袭能力从而研究这三种不同的姜酚成份是否对犬乳腺肿瘤细胞cipp的增殖迁移侵袭运动有影响，并对比其不同的抑制作用。若试验结果表明药物对细胞有较强的抑制作用，在还有时间与精力的情况下可进一步通过流式细胞术检测其对肿瘤细胞周期的影响，通过wb检测其蛋白水平的变化从而探究其抑制肿瘤细胞的作用机制。
技术路线：见附件
本研究主要涉及三种不同的试验即cck8试验，细胞迁移试验和细胞侵袭试验，不论是在人医或是动医的细胞研究，这些实验方案都是最基本也是最重要的。cck8试验全称为cellcounting kit，应用cck8/wst-8试剂盒，是一种基于wst-8的应用于细胞增殖和细胞毒性的快速检测高灵敏度检测试剂盒。其工作原理为：wst-8在电子耦合试剂存在情况下，可以被线粒体体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞的毒性成反比。使用酶标仪在450mm波长处测定od值，间接反映活细胞数量。细胞迁移试验主要通过细胞划痕修复试验，划痕修复试验是一种简单、廉价的方法，也是最早发展起来的研究定向细胞在体外迁移的方法之一。该方法模拟了细胞在体内愈合过程中的迁移过程。基本步骤包括在细胞单层中创建一个“伤口”，在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像以关闭伤口，以及比较图像以确定细胞迁移速率。细胞侵袭试验通过transwell小室进行，该小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将无血清的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的高血清成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
4. 研究创新点
本课题选用中药成分作为抗肿瘤药物进行研究，首次将姜酚药物作用于动物肿瘤细胞。
不同于人医的大部分单一药物实验，本课题将三种不同的主要姜酚成份即6-姜酚，8-姜酚与10-姜酚分别作用于动物细胞，同时开展CCK8细胞活性试验，细胞迁移试验与细胞侵袭试验，在测试每种药物对肿瘤细胞不同的抑制作用的同时更是将三种药物同时进行比较，从而选取最有效的药物以为之后的深入研究进行奠基。
5. 研究计划与进展
本研究课题计划在四个月之内完成姜酚药物的购买配制与主要的三个试验，即cck8细胞活性试验，细胞迁移试验与细胞侵袭试验。具体计划和预期进展如下：
第一个月：查阅文献，购买姜酚，学习基础实验（如细胞的复苏传代冻存等）
与涉及到的相关实验技术（即三种最主要的实验）
