1. 研究目的与意义
植物酯酶源丰富，取材方便，制备简单，植物酶中的乙酰胆碱酯酶(AChE)是一种重要的工具酶。它能够选择性地催化底物乙酰胆碱水解,且其催化活性能被有机磷或氨基甲酸酯类农药所抑制。利用这一特性可制成胆碱酯酶生物传感器,用于测定有机磷农药含量、底物含量及酶活性等。因而,AChE在环保、医学、农业、军事等领域具有重要用途。
由于游离酶性质不稳定,极易失活,不能重复使用,只有固定化酶才具有使用价值。研制胆碱酯酶生物传感器的前提条件是AChE的固定化,即利用物理或化学方法将AChE固定在各种载体上。与游离酶相比,固定化酶具有稳定性强,重现性好,能重复使用等优点。本文拟探讨影响固定化效果的重要影响因素，如吸附量、吸附pH、温度等，为乙酰胆碱酯酶的广泛应用提供了科学依据。
2. 国内外研究现状分析
1利用乙酰胆碱酯酶生物传感器监测海水中有机磷农药 本研究以预先筛选的鲅鱼乙酰胆碱酯酶(ache)为敏感材料，通过直接共价法将其固定于cnbr活化的sepharose 4b凝胶上。所制备的固定化酶在缓冲溶液中表现出高催化活力、高稳定性等优点：固定化酶对ph值和温度变化的适应能力均优于非固定酶(溶液酶)；在三个月的保存期内，固定化酶的活力仅损失了13％，而溶液酶的活力则下降了89％。说明固定过程能够大大提高ache对环境的抗逆性，有利于保持酶活的稳定。固定化ache与换能器(ph电极)可以组合为酶传感器。但是，在酶传感器应用于海水有机磷农药监测之前，应首先确定固定化酶在海水中的牢固性；对海水盐度、ph值、温度等条件的适应能力；底物溶液的适宜浓度和加入量等。这对于获得酶传感器的最佳工作条件十分重要。
结果表明，该固定化酶在同种海水中所表现的酶活之间具有良好的重现性(rsd=2.33％，n=12)；底物(碘化硫代乙酰胆碱)溶液的最佳浓度和注射量分别为41.6mmol几和40叱，过量底物对此固定化酶有抑制作用;海水的适宜流速 为0.39ml/min;环境条件对固定化酶的活性有一定影响，在盐度为24.9、ph为 7一9、温度为30℃时，固定化酶具有最高活性。
2固定化胰蛋白酶的制备及性质研究 自1969年日本田边制药公司(tanabe seiyaku )成功的将固定化酶应用于工业生产,开创固定化酶应用的新纪元后,固定化酶以稳定性高、可重复利用、反应条件易于控制等优点广泛应用于生产实践中,在酶的固定化方面,先后开发了多种固定化方法和性能多样的载体材料。 本文重点研究ph依赖的固定化酶反应器的性质:模拟研究了fish-in-net固定化技术中鱼小于网孔情况下,蛋白从传质通道内逃逸的具体条件;研究了固定化进程中,基于吸附的固定化酶制剂中酶与载体的相互作用形式,并探讨了酶制剂的ph、温度、粘度相关的催化能力变化;利用数学方法讨论ph对酶的固定化的影响及酶的最佳工作条件并建立了相关数学模型,即酶吸附固定化时,酶与硅基介孔笼形分子筛之间的关系可以简化为带电质点同带电圆柱型通道之间的作用关系,以期为更多的酶的吸附固定化提供支持和技术指导。
3. 研究的基本内容与计划
1、 选用纤维素、稻草、壳聚糖等固定胆碱酯酶，分别测定不同温度、ph值、时间和加酶量条件下固定化效果。
2、 比较游离酯酶和固定化酶的酶学性质，最适温度、ph，表观米氏常数，最大酶促反应速度。
3、 比较两种酶的酶活力、热稳定性和ph稳定性。
4. 研究创新点
本文以戊二醛为交联剂,将AChE固定到纤维素载体膜上。探讨了载体性质、酶用量、戊二醛用量、固定化时间、固定化温度等因素对固定化效果的影响,获得了最佳固定化条件。在最佳条件下制备的酶片,活力重现性好,性能稳定。
