1. 研究目的与意义
植物酯酶源丰富，取材方便，制备简单，可利用植物酶中的乙酰胆碱酯酶的抑制技术测定果蔬中有机磷和氨基甲酸酯类农药。但是酶液不易保存，适用范围有限，本文拟探讨影响固定化效果的重要影响因素，如酶液吸附量、吸附pH、固定化温度和固定化时间等，为乙酰胆碱酯酶的广泛应用提供了科学依据。酶的固定化是用固体材料，如壳聚糖微球等将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。目前,固定化酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一。研究探索新的酶固定化技术(如流体聚合包埋技术、纳米粒子原位共聚包埋等) 、提高固定化酶活性收率、延长半衰期、降低成本将成为固定化酶研究领域的主要研究内容。充分利用具有适宜生物相容性及亲水性的天然载体、运用当代高新技术对天然载体修饰改性以及开发合成性能优良的新的酶固定化载体材料、研究高分子材料与特定无机材料的复合材料以及合成酶固定化智能载体材料等将是固定化酶载体材料今后发展与应用的方向。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的要求。本实验研究的乙酰胆碱酯酶固定化，主要用于农药的检测，农药在保护农作物、防治病虫草害、改善人类生存环境、控制疾病方面发挥了巨大作用。但过多、
过滥地使用农药，致使生态环境和农产品的污染日趋严重，食品安全日益受到社会的关注。目前，我国食品农药残留最为严重的就是有机磷和氨基甲酸酯类农药。常规的仪器检测不适应我国蔬菜分散销售与市场经常性的现场快速检测需要。依据酶抑制原理建立有机磷农药残留快速检测法也越来越受到青睐，故研究固定化的乙酰胆碱酯酶，以便于更高效，快速，简便的检测出农药的含量。2. 国内外研究现状分析
固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
1943 年, korun首次提出乙酰胆碱酯酶. 1953 年,stedman 等首次从马血清中分离胆碱酯酶. 此后人们逐渐发现胆碱酯酶广泛存在于动物组织中。
酰胆碱酯酶能够特异性地催化乙酰胆碱( 或丁酰胆碱) 水解为胆碱和乙酸( 或丁酸) .遵义医学院的吕延成、万圣教授等利用壳聚糖制成注膜液，并且剪成小膜片来固定乙酰胆碱酯酶；中国海洋大学海洋环境与生态教育部的张爱静、孟范平教授也利用了壳聚糖制成微球固定乙酰胆碱酯酶，都取得了很好的效果。
3. 研究的基本内容与计划
实验开始于2月中旬，第一周主要查找文献资料，熟悉实验原理和步骤，制定实验方案；正式开始进实验室在第二周，首先配置各种所需的溶液，如：磷酸缓冲液，1mol/L NaOH溶液、1mol/LHCl溶液等等；3月，第一部分：探究树脂固定化乙酰胆碱酯酶，主要步骤：根据资料分别找出不同性质的树脂，经过酸洗碱洗盐洗等处理，与酶液反应，探究固定化条件如：树脂的种类、固定化温度、pH、给酶量、固定化时间等对酶的固定产生的影响；4月，第二部分：在第一部分树脂探究结果的基础上，利用该实验的最佳条件开始第二部分的实验，主要利用壳聚糖固定化乙酰胆碱酯酶，制备壳聚糖的方法：将50 mL 液体石蜡与20 mL span80 低速搅拌混匀,作为油相, 加入250 mL 质量分数2% 的CS 溶液( 2%醋酸配制) , 搅拌分散30 min, 再加入20 mL 2. 5%GA 搅拌1 h, 离心, 下层微球依次用乙醚、乙醇、水冲洗, 制得CS-MS, 于4℃水中保存，再同第一部分实验，探究出最佳条件；5月，第三部分：利用改性的壳聚糖制备固定化乙酰胆碱酯酶，由于壳聚糖的成本较高，所以利用膨润土代替部分壳聚糖制备，同样的方法探究最有条件，并且与完全壳聚糖制备的相比较；第四部分：总结实验结果，并通过计算得出结论，并和指导老师探讨实验结果；第五部分：完成论文的写作和上传，等待老师的审核；第六部分：论文答辩；
4. 研究创新点
1、树脂价格较低，利用树脂固定乙酰胆碱酯酶制作工艺简单；
2、一般都是采用树脂固定化植物酯酶或蛋白酶等，很少有探究树脂固定乙酰胆碱酯酶，且在探究过程中也可以采用处理过的树脂，即加入十六烷基三甲基溴化铵60℃震荡5小时，改变树脂的极性，从而提高树脂的固定化效果；
3、壳聚糖微球的制备是一个比较复杂的过程，要不断探究制备过程中离心的转速、时间等条件，且小球的形状和大小都不固定，这样会影响实验结果，故采用其他方法制备壳聚糖微球，利用壳聚糖和乙酸溶液组成的胶粘物，通过针筒挤出小球，这样的小球大小形状都比较统一，有利于实验的准确性；
