1. 研究目的与意义
研究背景：
抗生素是抗生素是指由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而获得的或是用化学合成法合成的结构相同或类似的具有杀灭或抑制病原微生物的物质。其作用是为了抑制或杀灭的风险，是治疗感染性疾病的有力武器，使严重威胁人类健康的感染性疾病得到了很好的控制。抗生素除了用于预防和治疗人类疾病外，在畜牧业和水产养殖业中发挥着重要的作用。
近年来，随着集约化畜牧养殖业及饲料工业的发展，四环素类、青霉素类、大环内酯类、喹诺酮类、磺胺嘧啶等抗生素开始作为禽畜饲料添加剂被广泛的应用于禽畜养殖业和水产养殖业。研究表明，抗生素摄入后除少部分残留在生物体内，大部分以原药和代谢产物的形式经由动物的粪尿排出体外，通过各种途径进入到环境中，从而使得原土著微生物群落遭到破坏。微生物群落结构发生变化，进一步影响到微生物群落所在的土壤及水体环境。对土壤环境来说，微生物种类和数量发生变化会可能会影响土壤微生物的固定或降解能力，还可能导致土壤结构发生变化，对土壤肥力产生影响。因此，抗生素对环境介质和生态系统必定产生深远的影响。
2. 研究内容和预期目标
内容：
本实验以不同浓度的四环素作为污染胁迫，采用国标方法，测定土壤的基本理化性质。采用底物诱导呼吸速率实验测定土壤微生物co2呼吸量，并采用 originpro 8.0 软件分析所得呼吸数据，进而确定不同浓度四环素胁迫下土壤微生物的活性。通过plfa脂肪酸提取方法聚类分析来检测土壤微生物群落结构变化及优势菌群，从微生物的角度阐明抗生素胁迫下土壤微生物的动态变化情况和土壤生态功能稳定性之间的相关性。
3. 研究的方法与步骤
方法：
底物诱导呼吸速率实验
PLFA测定微生物群落结构
国标方法测定该土壤理化性质
步骤：
1、样品采集及预处理
a. 样品的采集：选取树木较多并且土壤未被污染的地区取样，取样时，除去1厘米左右的浮土，然后采集适量表层0-20cm深度的洁净泥土。取三个点位混匀共取4kg土壤。
b. 采样地点：苏州
c. 样品的保存：将样品密封好置于冰箱4℃保鲜
d. 抗生素：四环素（纯度98%）
2、实验分组
a.四环素浓度梯度设置：0、 50、 100、 105、 200、 300 (mg/kg)
b.采样时间：胁迫后1、3、7、15、45天采样，测定土壤微生物CO2呼吸量；
c.实验组（抗生素胁迫）：土壤（12g），个浓度每土壤样品做3组平行；
对照组：土壤（12g），土壤样品做3组平行。
3、理化性质的测定：
本实验对土壤样品，采用称重法（NY/T 52-1987）测定含水率；电位法（NY/T 1121.2-2006）测定pH值；吸管法（LY/T 1225-1999）测定粒径；乙酸铵交换法和氯化铵-乙酸铵交换法(LY/T 1243-1999)测定阳离子交换量（CEC）；碳氮元素分析仪（Vario MAX CN）测定总碳（TC）、总氮（TN）以及碳氮比（C/N）；水提法预处理后，总有机碳分析仪（TOC-VCPH，SHIMADZU，Japan）测定溶解性有机碳（DOC）。
4、底物诱导呼吸速率实验
分别取土壤12g置于250 毫升塑料瓶中，同时将含水率控制在 15%。土壤被随机进行二种方式处理：①控制，无扰动施加；②胁迫，加入已配制的相应浓度的四环素。然后均向处理①、②装有 12g 土样的瓶中加入0.36g 葡萄糖。将装有 5ml 0.2mol/L的 NaOH 溶液的玻璃瓶放置在250 毫升塑料瓶中，用于捕捉土壤有机质矿化所生成的二氧化碳。塑料瓶密封，并在 28℃下培养12 小时。塑料瓶从培养箱中取出后， 迅速将NaOH液体转移至100ml三角瓶中，加入2ml 1mol/L的 BaCl2溶液，再加两滴酚酞，采用滴定的 HCl 浓度为0.05mol/L。每组处理有3 个重复，另取 3 个不加土壤的瓶子作为空白。
5、PLFA测定微生物群落结构
称取相当于 8g 干重的土壤，置于 35ml 离心管中，向离心管中加入 5ml 磷酸缓冲液，再加入 6ml 三氯甲烷，12ml 甲醇，振荡2小时，25℃，3500 rpm, 离心 10 分钟，上层离心液倒入分液漏，加 12ml 三氯甲烷，12ml磷酸缓冲液于分液漏斗中，摇动 2 分钟。加入 23ml 提取液于离心管中的剩余土壤中，手工摇动，振荡 30 分钟，25℃，3500 rpm, 离心 10 分钟，上层离心液倒入分液漏斗，静置过夜，下层加水，摇动，丢弃多余土壤，用清洗剂洗刷离心管。
将分液漏斗中下层溶液放入大试管 A 中，30-32℃水浴，N2浓缩，加3ml三氯甲烷调解萃取小柱，5份200微升三氯甲烷转移浓缩磷脂到萃取小柱。向萃取小柱加入 5ml 三氯甲烷，加2次5ml丙酮，甲醇清洗萃取小柱底部，加5ml甲醇，大试管 B收集淋洗液，32℃水浴，N2浓缩，加 1ml 1:1 甲醇：甲苯，1ml 0.2M 氢氧化钾溶液，摇匀。37℃水浴加热15分钟，加 0.3ml 1M 醋酸溶液，2ml 己烷，2ml 超纯水，低速振荡 10 分钟。下层加 2ml己烷，再振荡 10 分钟，上层己烷溶液移入小瓶。N2脱水干燥。用移液枪加2次100微升己烷于干燥样品中，转入色谱仪专用的内衬管，2-3 天内检测。
第0天，第1天，第3天，第7天，15天，45天取土样分别测定微生物群落结构。
附：实验记录（表格）设计 ：
| CO2呼吸量 | 土壤（无胁迫对照） | 土壤（抗生素胁迫） | ||||
| 0 | 50 | 100 | 150 | 200 | 300 | |
| 第1天 |
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| 第3天 |
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| 第7天 |
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| 第15天 |
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| 第45天 |
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4. 参考文献
[1]张慧敏,章明奎,顾国平．浙北地区畜禽粪便和农田土壤中四环素类抗生素残留.生态与农村环境学报,2008, 24( 3) : 69-73．
[2]陈昦,董元华,王辉,安琼,张劲强,刘新程.江苏省畜禽粪便中磺胺类药物残留特征.农业环境科学学报,2008, 27( 1) : 385-389．
[3]周启星. 2006. 土壤环境污染化学与化学修复研究最新进展[ j] . 环境化学, 25( 3) : 257- 265
5. 计划与进度安排
| 序号 | 起迄日期 | 工作内容 |
| 1 | 2.23-2.28 | 搜集资料，阅读相关文献 |
| 2 | 2.29 | 制定实验方案 |
| 3 | 3.1 | 取土并测定含水率 |
| 4 | 3.1-3.8 | 风干土壤 |
| 5 | 3.9 | 过筛并测土壤含水率 |
| 6 | 3.11-3.18 | 调含水率至15% |
| 7 | 3.19 | 加入抗生素 |
| 8 | 3.21 | 底物诱导呼吸第1天（滴定实验） |
| 9 | 3.22 | 土壤理化性质（全碳）测定 |
| 10 | 3.23 | 底物诱导呼吸第3天（滴定实验） |
| 11 | 3.24 | 土壤理化性质（阳离子交换量测定） |
| 12 | 3.27 | 底物诱导呼吸第7天（滴定实验） |
| 13 | 4.4 | 底物诱导呼吸第15天（滴定实验） |
| 14 | 4.10 | 土壤理化性质（全氮）测定 |
| 15 | 4.15-4.17 | PLFA测定 |
| 16 | 4.19 | 土壤理化性质（pH的测定） |
| 17 | 4.20-4.22 | 数据处理并得出结论 |
| 18 | 4.23-6.1 | 撰写并修改论文 |
| 19 | 6.1-6.8 | 准备毕业论文答辩 |
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