不同比例藻菌共生体对砷酸盐富集和转化的研究开题报告

一、课题的意义及国内外研究进展

1978年，联合国美国环境保护署（USEPA）就废水中构成严重危害的污染物质列出了一份清单，其中包括以下13种金属：锑，砷，铍，镉，铬，铜，铅，汞，镍，硒，银，铊和锌。据估算全世界大约有1亿人口处在砷浓度大于50 μg·L^-1的环境中^[1]。国际癌症研究组织将砷纳为致癌物A类，由于砷的急性致死率，世界卫生组织规定饮用水中砷的安全标准为10 μg·L^-1[2]。有研究表明，近几十年在东亚和东南亚，由于饮用水源中含有高含量的砷，已导致约数百万人砷中毒^[3]。纵观全世界，水体砷污染事件比比皆是。

放眼国内，2008年秋天，位于大沙河上游民权县的成城公司使用劣质矿石生产硫酸，大量砷随废水直接排入大沙河，致使河水含砷浓度超标899倍，1000余万吨河水被污染，酿成了国内最大的砷污染事件。以及2007年贵州省独山县一硫酸厂非法将大量含砷废水排入都柳江上游河道，使该县十余村民轻微中毒，造成下游三都水族自治县县城及沿河乡镇2万多人生活饮水困难。

在全球其他国家也曾多次出现水环境砷污染事件。美国犹他州曾报道过饮用井水中砷含量高达180~210 μg·L^-1，且以砷酸盐[As(V)]为主要形态^[4]。有报道显示，加拿大落基山地区深井水中砷含量为100~410 μg·L^-1[5]。在加拿大的哈利法克斯县，美国俄勒冈州西部、加利福尼亚州，大洋洲的新西兰，欧洲的波兰，西班牙等也出现过水源砷污染事件。

砷经污染的水、空气、食物进入人体后，根据进入人体的多少会引起急性或慢性砷中毒。所以水体砷污染对人类健康造成严重危害，使砷污染成为全球非常突出且急需解决的问题之一。

而目前砷污染水体的处理方法包括物理化学法：沉淀法、离子交换法、吸附法、中和氧化法、膜分离法和电解法；生物法：微生物法和植物除砷法等^[6]。相比之下，近几年国内外对利用微生物处理砷污染水体的研究较多，利用细菌、真菌和藻类将砷从水体中分离或降低其毒性，效率高且适用性广。其中藻类作为一种新型、廉价的生物处理剂，得到国内外学者的关注，在藻类去除水体砷的吸附机制、影响因素、动力学分析等方面都已有诸多理论成果。

微藻是水体环境中主要的初级生产者，通常为单细胞或多细胞群体，能够进行光合作用的水生低等植物，是很多生物赖以生存的物质基础，也是甲壳类等水产经济动物的优质饵料^[7]。藻类的来源丰富，廉价易得，适合用于低浓度重金属污染处理，藻类具有大的表面积，吸附容量大，具有良好的选择性，对重金属达到高的去除率，而且不产生二次污染。也有研究表明，藻类应用范围广、pH值和温度范围广^[8-9]。所以说微藻不仅可用来去除水环境中的重金属，甚至可以用来处理回收水体中的金属，具有高效、低耗、环保等优点^[10]。

近些年来关于藻类富集重金属的性能已有研究证明。张兵等^[9]研究集胞藻在含磷培养基中对不同形态砷的吸收动力学特征，As(III)的最大吸收速率大于As(V)的最大吸收速率，而集胞藻对As(V)的亲和性大于As(III)。作者还考察了集胞藻对含砷溶液的净化作用，72 h集胞藻净化效率能达到41 %，此结果表明集胞藻具有修复砷污染水体的潜力^[11]。

Henrik K等^[12]研究了淡黑巨海藻在不同pH条件下对于As（V）的富集效果，结果显示在pH 2.5条件下淡黑巨海藻对于As（V）的吸附效果达到45.2 mg·g^-1。Johansson^[13]等研究发现鞘藻类对于As的吸附效果大于80.7 mg·g^-1。李妍丽^[14]等研究了Selenastrum capricormulum、Chlorella vulgaris、Chlorella minata、Chlorella sp.（100ai）和Chlorella sp.（zfsaia）五种藻类对As（V）的去除率，S.capricormulum对As（V）的去除率可以达到85.45 %，五种藻类对As（V）的吸附能力大小为：S.capricormulumC.vulgarisChlorella sp.（zfsaia）Chlorellasp.（100ai）C.minata。

藻菌共生系统这一概念的问世是在20世纪六十年代由William Oswald^[15]等学者提出。藻类和细菌是水生态系统中两类有密切关系的生物,它们在水体的物质循环和污水净化中都起着非常重要的作用^[16]。微藻可对重金属和造成水体富营养化的营养物等进行有效地去除^[17]。细菌、真菌等微生物可降解大分子有机物、氨氮等。将两类生物结合起来,构成藻类-细菌共生系统后，水体中的有机物就会被好氧细菌氧化分解，生成铵态氮、磷酸盐和二氧化碳，藻类可利用这些营养物质以及阳光作为能源，光合合成细胞物质。在这个过程中，藻释放出氧气，从而使细菌继续氧化有机物质，这就是目前公认的藻菌共生方式^[18]。

此外，许多学者经过研究发现，薇藻和细菌之间存在协同作用，如Kim^[19]等研究表明根瘤菌能够促进莱茵衣藻、普通小球藻、栅藻的生长，且生长率提高了11 %；Xie等^[22]发现，培养7d条件下，添加异养细菌培养的微藻产量是单独微藻培养的4.8倍，表明异养细菌的添加显著促进了微藻的生长；李交昆等^[20]研究表明，根际促生菌如假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、根瘤菌属（Rhizobium）等能够通过生物吸附、甲基化作用、氧化还原等作用来减轻重金属的毒害作用，同时通过产生有机酸、EPS、生长激素、生物表面活性剂等，提高藻类的重金属抗性^[21]；正是这种藻菌间的协同作用在污水治理方面起到了显著的效果^[23]。

而且微藻与细菌共生结合了微藻吸附容量大和细菌培养成本低的优势，被国内外学者开发为生物反应器、生物滤器等装置，在含有重金属、氮磷、有机污染物的污水处理上有较多应用。近期国外学者研究发现，藻菌共生体对污水中Cu、Cd等重金属污染物的富集具有重要作用^[25,26]，高敏等^[27]研究了淡水藻类及其伴生细菌形成的藻菌共生系统对污水中微量重金属镉的去除效果。王亚飞等^[28]运用固定技术构建藻菌体系，固定化藻菌对Zn² 的去除效果均优于悬浮小球藻。许平平等^[29]研究表明共生细菌能够影响盐生小球藻对砷酸盐的吸收、吸附和形态转化，小球藻与细菌共生增强了砷污染水体的生物修复效果。

综上所述，关于不同藻菌比例构建的共生体去除砷的研究目前未见报道，所以本文选取对重金属处理效果较优的藻类—盐生小球藻，以及已证明对小球藻有益的细菌—芽孢杆菌来进行实验，研究不同比例藻菌共生体对砷酸盐的富集和形态转化，为水体砷污染的去除提供理论依据。

二、应用前景

利用藻菌处理污染水体并对藻菌进行资源化利用具有较好的发展前景。随着各种相关研究的不断深入,利用藻菌共生系统处理重金属及氮磷污染的各种技术将会逐渐成熟,未来技术若能成熟开发有利于共生系统形成与维持的设备仪器,并优化工作参数，可研发合成藻菌共生微生物吸附剂，从而能够产生更大的环境经济效益。

三、参考文献

[1] MOON K, GUALLAR E, NAVAS-ACIEN A. Arsenic exposure and cardiovascular disease:An updated systematic review[J]. Current Atherosclerosis Reports, 2012, 14(6):542-555.

[2] WHO (World Health Organization), Arsenic in Drinking Water, Fact Sheet No.210, Geneva, 1999.

[3] Zhao F J, Ma J F, Meharg A A, et al. Arsenic uptake and metabolism in plants[J]. New Phytologist, 2009, 181(4): 777-794.

[4] Mandal B K, Suzuki K T. Arsenic round the world: a review[J]. Talanta, 2002, 58(1): 201-235.

[5] Wyllie J. An investigation of the source of arsenic in a well water[J]. Canadian Public Health Journal, 1937, 28(3): 128-135.

[6] Golueke C G, Oswald W J, Gee H K.Effect of nitrogen additives on algal yield[J]. Journal of Water Pollution Control Federation, 1967, 39 (39) :823-34.

[7]朴永哲,黄玮,崔玉波.细菌对重金属的抗性及解毒机理研究进展[J].安全与环境学报, 2015, 15(06): 250-254.

[8]孟春晓,高政权.微藻对重金属污染的生物修复研究现状与展望[J].水产科学, 2009, 28(12): 795-797.

[9]潘进芬,林荣根.海洋微藻吸附重金属的机理研究[J].海洋科学, 2000, 24(2): 31-34.

[10]陆开形,唐建军,蒋德安.藻类富集重金属的特点及其应用展望[J].应用生态学报, 2006, 17(1): 118-122.

[11]张兵,王利红,徐玉新,尹西翔.集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)对砷吸收转化特性的初步研究[J].生态毒理学报, 2011, 6(06): 629-633.

[12] Hansen H K , Ribeiro A , Mateus E . Biosorption of arsenic(V) with Lessonia nigrescens[J]. Minerals Engineering, 2006, 19(5):486-490.

[13] Johansson C L , Paul N A , De Nys R , et al. Simultaneous biosorption of selenium, arsenic and molybdenum with modified algal-based biochars[J]. Journal of Environmental Management, 2016, 165:117-123.

[14]李妍丽.微型绿藻对砷污染水体的生物修复研究[D].华南理工大学, 2012.

[15] Golueke C G, Oswald W J, Gee H K.Effect of nitrogen additives on algal yield[J]. Journal of Water Pollution Control Federation, 1967, 39 (39) :823-34.

[16]郑耀通,吴小平,高树芳.固定化藻菌系统去除氨氮影响[J].江西农业大学学报, 2003, 25 (1) :99-102.

[17]巫小丹,阮榕生,王辉,等.藻菌共生系统处理废水研究现状及发展前景[J].环境工程, 2014, 32 (3) :34-37, 69.

[18] Ji X, Jiang M, Zhang J, et al. The interactions of algae-bacteria symbiotic system and its effects on nutrients removal from synthetic wastewater.[J]. Bioresource Technology, 2017, 247:44.

[19] Kim B H, Ramanan R, Cho D H, et al. Role of Rhizobium, a plant growth promoting bacterium, in enhancing algal biomass through mutualistic interaction[J]. Biomass and Bioenergy, 2014, 69: 95-105.

[20]李交昆,余黄,曾伟民,等.根际促生菌强化植物修复重金属污染土壤的研究进展[J].生命科学, 2017, 29(5): 434-442.

[21]麦靖雯,黎瑞君,张巨明.植物根际促生菌研究综述[J].现代农业科技, 2018(12): 179-180 183.

[22] Xie W Y, Su J Q, Zhu Y G. Arsenite oxidation by the phyllosphere bacterial community associated with Wolffia Australiana[J]. Environmental Science and Technology, 2014, 48(16): 9668-9674.

[23] Amavizca E, Bashan Y, Ryu C M, et al. Enhanced performance of the microalga Chlorella sorokiniana remotely induced by the plant growth-promoting bacteria Azospirillum brasilense and Bacillus pumilus[J]. Scientific Reports, 2017, 7: 41310.

[24]孙霓.菌-藻共生SBR处理生活污水的效能与特性[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学, 2016.

[25] Munoz R, Guieysse B. Algal-bacterial processes for the treatment of hazardous contaminants: a review[J]. Water research, 2006, 40(15): 2799-2815.

[26] Loutseti S, Danielidis D B, Economou-Amilli A, et al. The application of a micro-algal/bacterial biofilter for the detoxification of copper and cadmium metal wastes[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(7): 2099-2105.

[27]高敏,李茹.藻菌共生生物膜对重金属镉的去除[J].西安工程大学学报, 2016, 30(02):170-176.

[28]王亚飞,傅海燕,黄国和,柴天,高攀峰,许鹏成,王进羽.固定化小球藻与活性污泥的共生系统处理含锌废水[J].环境工程学报, 2014, 8(04): 1379-1384.

[29]许平平,刘聪,王亚,郑燕恒,张春华,葛滢.共生细菌对盐生小球藻富集和转化砷酸盐的影响[J].环境科学, 2016, 37(09): 3438-3446.

八、研究方法

1、培养条件

盐生小球藻培养液采用f/2培养基，pH为8.0±0.02，在121℃下灭菌30min；培养条件：(25±1)℃；光照强度为3500~4000 lx，且维持光暗比（12h:12h）；且在藻种传代扩增及培养过程中均保证无菌操作。枯草芽孢杆菌培养基为营养肉汁，培养温度均为30℃。

2、小球藻与芽孢杆菌细胞个数与OD的关系

（1）盐生小球藻培养到对数生长期后，浓缩到150ml的新鲜培养基中，设置不同的稀释浓度，测定藻的OD，将不同浓度的藻细胞至于流式细胞仪中，测定细胞个数，得到OD与细胞个数的关系。

（2）芽孢杆菌培养至对数生长期后，浓缩于150ml的生理盐水中，取浓缩菌液1、2、4、5、7、8、9、10ml于10ml离心管中，将体系加生理盐水补到10ml，测定稀释不同浓度的菌液的OD值，然后在将这些菌液稀释至10^-5，取10微升进行涂布，待细菌长出后数菌落个数，计算细菌个数与OD的关系。

3、藻菌共生体系的构建

（1）将生长至对数生长期的盐生小球藻浓缩至300ml f/2培养基中，测定其OD值，根据盐生小球藻细胞个数与OD的关系计算出此时的细胞个数（每批实验基本保持初始细胞个数相同）。将生长至对数生长期的细菌浓缩至300ml的生理盐水中，测定其OD值，根据芽孢杆菌细胞个数与OD的关系计算此时的菌细胞个数。

（2）设置藻菌比为1:0、1:1、1:2、1:3、1:4，测定四个共生体系在不同比例下的生长情况，测定生长指标如叶绿素含量、干重、EPS确定共生体系构建成功。

4、藻菌共生体系各项指标测定

（1）叶绿素：吸取4ml藻液，在离心力8000g条件下，离心5min，去除上清液，加入甲醇在-4℃暗反应条件下，浸提24小时后，用酶标仪分别在666、653、470波长下测定吸光值。通过公式：

叶绿素A：Ca=15.65A666-7.34A653

叶绿素B：Cb=27.05A653-11.21A666

类胡萝卜素：Cx c=1000A470-2.86Ca-1.292Cb/245

叶绿素=叶绿素A 叶绿素B

（2）细胞干重：将离心管称重后标记，每天吸取藻液离心，冷冻干燥后称重，用差减法计算最终干重。

（3）EPS：微藻胞外多聚物分为两部分，上清液中的胞外多聚物和细胞周围的胞外多聚物为了提取这两部分，先通过离心的方式收集全部的EPS，再通过加热法得到EPS。蛋白测定：蛋白质含量的测定以牛血清白蛋白为基本物质，采用考马斯亮蓝法，向试管中加入1mL的待测样品，加入考马斯亮蓝染液（称取考马斯亮蓝G-250 0.1g,溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL质量浓度为0.85 g·mL^-1的磷酸，定容至1000 mL）5 mL，震荡混匀，显色5 min后用分光光度计在595 nm处进行测定。多糖测定：以葡萄糖为基准物质，采用苯酚-硫酸法，向试管中加入1 mL待测样品，加入显色液（5%苯酚溶液与98%浓硫酸按体积比1:5混合）3 mL，混匀并放置于100℃的沸水中加热25 min，冷却至室温后用分光光度计在490 nm处进行测定。核酸测定:DNA的测定以小牛胸腺DNA为标准物质，采用二苯胺法。向试管中加入待测样品2 mL，二苯胺试剂（称取1 g二苯胺，溶于100 mL冰乙酸中，加入60%以上的过氯酸10 mL，混匀待用。临用前加入1 mL的1.6%乙醛）4 mL，混匀后于60℃水浴加热1 h，冷却至室温后用分光光度计在595nm处进行测定。

5、藻菌共生体系培养液中氮磷的测定

将一定量的藻菌共生体离心后取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后用ICP-OES（PerkinElmer Optima 2100D）测培养液中P含量。

6、盐生小球藻-芽孢杆菌共生体对As(V)的吸附与吸收

在盐生小球藻和芽孢杆菌生长的对数期，进行藻菌共生体的构建。向藻菌共生体系中施加不同浓度的As处理，以不施加重金属的藻菌共生体系作为对照。每组三个平行，每天定时摇藻三次，连续培养七天后收集样品。

（1）测定藻菌共生体中的砷含量：收取50ml藻菌样，离心后，收集上清液，用于培养液中的砷含量的测定。藻菌样进行冷冻干燥，称取冷冻干燥的藻菌样0.01 g加入2 ml混酸（硝酸：高氯酸=4:1）静置过夜，使用电热消解炉在120℃下消解至澄清，开盖赶酸，剩约0.5 ml，使用去离子水转移至10 ml容量瓶并用还原剂和盐酸稀释相应的倍数后得到样品。用氢化物发生-双道原子荧光光度计测定消煮后样品与收集的上清液得到藻菌共生体培养液和富集的砷含量。

（2）测定藻菌共生体内的砷含量：收集藻菌样20 ml，离心后弃上清液，加入PBS

缓冲液5 ml，浸泡10 ml然后离心10 min，重复2-3次，去除细胞表面吸附的砷。将得到的藻菌样冷冻干燥，进行消煮（方法同上）。用原子荧光形态分析仪测定藻菌共生体内的砷含量。

（3）测定藻菌共生体砷形态：离心收集20 ml培样7天的藻菌共生体，使用PBS清洗，再用1.75%的硝酸及水微波辅助法进行体取，即在藻样中加入2 ml稀硝酸90℃

超声10 min，14000g离心10 min，收集上清液，重复2-3次定容1 ml使用0.2 μm水系滤头过滤后，用原子荧光测定As的形态。

（4）基团变化：利用红外光谱测定菌藻共生体与As反应前后的基团变化。将加砷藻菌共生体进行离心清洗弃上清液，将藻菌共生体冷冻干燥。取1-2mg生物样品与100mg的干燥的溴化钾（光谱纯）在玛瑙研钵中混匀并研成细粉末，装入磨具，在压片机上压制成透明薄片，利用傅里叶红外光谱进行扫描测定。

九、技术路线

十、可行性分析

目前已有许多微藻及细菌对重金属和N、P去除的相关研究。而且国内外关于藻菌共生体构建的相关文献内容、方法也可提供参考。此外，本课题组在藻类共生细菌这方面做了很多研究，也发表过多篇关于藻菌共生体系对As影响的论文，熟悉藻类培养、样品制备、元素含量和形态的分析测定，在重金属形态的化学分析等方面具有良好的研究基础，同时熟练掌握了等离子体原子发射光谱、原子荧光光谱等分析技术，实验室具有相关的仪器设备仪器的使用。综上来看，该课题可行性从理论及实践方面来说均可行。