1. 研究目的与意义
实验的目的在于通过一定的生物手段对来源于Thermotogathermarum中的α-甘露糖苷酶进行研究，以期确定其在药物开发、生物降解和生物催化过程的应用。
α-甘露糖苷酶在生物体中是一类关键性糖苷酶，是由多个成员组成的一个家族。自然界现有糖苷酶普遍存在含量少、稳定性差、底物特异性不高、催化能力低等问题，远不能满足需求，加之目前对糖苷酶作用机理认识的深入，糖苷酶应用价值愈加显现出来，迫切需要对其进行改造使之更符合人们要求。筛选能提高其催化活性、识别不同底物或抑制剂、改造和扩大催化应用的糖苷酶，为生产有治疗意义的抑制剂及设计有用合成工具开辟道路。
2. 国内外研究现状分析
α-甘露糖苷酶（α-mannosidase,ama）是一种参与糖蛋白合成和代谢的重要蛋白酶,它的功能是修剪n-聚糖中的甘露糖。α-甘露糖苷酶多具有糖苷水解酶38、47家族保守序列，目前已测序的α-甘露糖苷酶基因序列超过2000多种，已克隆的α-甘露糖苷酶cdna有二十多种,其中来自人类的有6种。根据α-甘露糖苷酶基因保守序列可将其分为三类，分别为i类ama、ii类ama和未分类ama[1]。i类ama属于gh47家族，特异作用于α-1,2-糖苷键，相对分子量为63-73kda，主要位于酵母和哺乳动物的高尔基体和内质网中。ii类ama异源性较大，相对分子质量介于107kda和136kda之间，可特异性的作用于α-1,2-,α-1,3-和α-1,6-甘露糖苷键。它们主要包括lam，giiam和哺乳动物胞浆/内质网ama，它们可以水解芳基化的糖苷。近年来，除了gh38、gh37家族的糖苷水解酶之外，在gh92、gh99和gh125家族中也存在ama，这些新发现的ama作用与i类或者ii类的作用相似，主要催化低聚糖的反应，我们称之为未分类ama。
α-甘露糖苷酶是植物细胞壁糖蛋白代谢过程中的关键性糖苷酶，在植物果实发育成熟过程中起着重要的作用。在生物体中α-甘露糖苷酶的作用主要是修剪聚糖中的甘露糖，糖蛋白形成在大多机体的蛋白质在合成过程中要经过糖基化。α-甘露糖苷酶在生物体中是一类关键性糖苷酶，能够参与n-糖基化的加工与成熟。蛋白质的n-糖基化在进化上是一个高度保守的代谢过程，对于所有真核生物的生长发育都是必不可少的。蛋白质的n-糖基化由多种酶调控，不同类型的糖甘酶和糖基转移酶催化蛋白质n-糖基化的糖修饰。α-甘露糖苷酶是一类关键性糖苷酶,由很多成员组成。α-甘露糖苷酶主要存在于内质网、高尔基体、溶酶体和胞浆其它细胞器中[2]，功能是剪接寡糖结构末端不同连接的甘露糖残基，形成高甘露糖型、复杂型、杂合型的n-寡糖[3]。不同类型的α-甘露糖甘酶的功能是修剪糖蛋白糖链中不同连接的甘露糖基，它不仅在糖蛋白的形成过程中发挥重要作用，而且也参与糖蛋白在溶酶体中的降解过程。
到目前为止，与α-甘露糖苷酶相关的疾病,人类已发现了九种疾病与糖基化过程有关,它们都属于常染色体隐性遗传病[4]。n-糖基化成熟和降解过程中每一个糖基的修剪都是由特异的酶所催化,其中任一环节的酶缺乏或不足,都可导致细胞内和分泌糖蛋白的糖基化不全,产生先天性糖基化功能紊乱的病理症状。目前发现的由α-甘露糖苷酶的缺失和不足等原因导致的疾病有先天性红细胞生成异常性贫血Ⅱ型和甘露糖苷贮积症[5]。
3. 研究的基本内容与计划
本研究拟采用来源于thermotogathermarumα-甘露糖苷酶基因在e.colibl21（de3）中诱导表达，采取不同的表达载体进行重组表达，以期获得高效表达α-甘露糖苷酶的重组菌，并对该酶的酶学特性进行分析。
2011.03.01~2011.03.07查阅文献，了解实验背景及原理
2011.03.08~2011.03.12制定实验方案，实验前期准备
4. 研究创新点
目前国内外关于α-甘露糖苷酶的研究较少，本实验通过对来源于Thermotogathermarum中的α-甘露糖苷酶进行研究，以期确定α-甘露糖苷酶的特色以及它在药物开发，生物降解和生物催化过程中的应用。
