1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1课题意义
病原微生物种类繁多，不断变异，快速准确地进行病原检测对防控疾病发生、保障公共卫生安全具有重要意义。已有病原检测技术的基础上，研究者进一步探索敏感性高、特异性强、耗时短、成本低、便捷度高、操作简便的病原检测方法，crispr技术的出现给病原检测和临床应用提供新的参考和思路。除作为基因编辑工具以用于动植物基因功能研究和基因修饰与治疗，crispr基因编辑标记技术近年来报道应用于微生物的检测中，能够显著优化核酸产物的识别体系[1]。牛疱疹病毒1型(bovineherpes virus,bhv-1)是牛传染性鼻气管炎(infectious bovinerhinotracheitis,ibr)的致病因子,bhv-1基因组为双股线性dna,其gb基因具有高度保守性[2,3]，课题以lbcas12a基因组序列为模板扩增目的基因，利用xho i和ecor i双酶切空载质粒，再以同源重组的方式连接目的片段及空载线性质粒，后经化学转化至dh5α使得lbcas12a整合至空载质粒pet28tev上，再以双酶切鉴定重组产物，并将鉴定正确的pet28tev-lbcas12a质粒化学转化至表达用bl21大肠杆菌工程菌株以完成lbcas12a蛋白表达载体的构建，摸索合适的蛋白表达条件以完成原核表达，并纯化鉴定目的蛋白lbcas12a。后期课题拟将牛疱疹病毒1型作为示范菌株，利用制备的cas12a蛋白，并根据bhv-1 gb保守序列设计引物及crrna以建立crispr/cas12a基因编辑体系继而实现crispr/cas12a蛋白在crrna引导下特异性识别、切割含pam序列的双链dna，并反式切割核酸探针，完成对扩增结果的准确鉴定。crispr/cas12a基因编辑体系的建立为下游crispr/cas12蛋白反式切割核酸探针实现可视化判读奠定基础，也为crispr/cas基因编辑体系应用于其他双链dna病原检测提供新的借鉴和参考。
1.2 国内外研究进展
2. 研究的基本内容和问题
2.1 研究目标
课题以lbcas12a基因组序列为模板扩增目的基因，利用xho i和ecor i双酶切空载质粒，再以同源重组的方式连接目的片段及空载线性质粒，后经化学转化至dh5α使得lbcas12a整合至空载质粒pet28tev上，再以双酶切鉴定重组产物，并将鉴定正确的pet28tev-lbcas12a质粒化学转化至表达用bl21大肠杆菌工程菌株以完成lbcas12a蛋白表达载体的构建，摸索合适的蛋白表达条件以完成原核表达，并纯化鉴定目的蛋白lbcas12a。后期课题拟将牛疱疹病毒1型作为示范菌株，利用制备的cas12a蛋白，并根据bhv-1 gb保守序列设计引物及crrna以建立crispr/cas12a基因编辑体系继而实现crispr/cas12a蛋白在crrna引导下特异性识别、切割含pam序列的双链dna，并反式切割核酸探针，完成对扩增结果的准确鉴定。
2.2 研究内容
3. 研究的方法与方案
3.1 研究方法
3.1.1Cas12a蛋白表达载体的构建
以LbCas12a基因组为模板，PCR扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳分离出目的基因，并以凝胶成像技术鉴定扩增产物，对鉴定正确的扩增产物片段回收，以作为同源重组的插入片段。
与此同时制备pET28TEV空载质粒线性化载体，使用Xho I和EcoR I双酶切空载质粒pET28TEV，按照双酶切反应体系加入相应量的Xho I、EcoR I、pET28TEV空载质粒，并置于37℃水浴锅反应1 h，待双酶切反应结束，回收反应液以用于琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，并以胶回收试剂盒回收纯化，酶切产物作为同源重组的线性化载体。
将获得的目的片段及线性化载体利用同源重组后经化学转化至DH5α的方式，使得LbCas12a整合到空载质粒pET28TEV上，使用质粒快速提取试剂盒获取的重组产物，利用Xho I和EcoR I双酶切质粒，以鉴定结果。并将鉴定正确的pET28TEV-LbCpf1重组质粒化学转化至表达用BL21大肠杆菌工程菌株。
3.1.2 Cas12a蛋白的表达与纯化
3.1.2.1 Cas12a蛋白的表达
（1）将含有LbCas12a基因的质粒化学转化至BL21感受态细胞中，铺平板于37℃恒温过夜培养
化转流程：
1.将pET28TEV-LbCasl2a质粒，离心（3000rpm；2min)；在质粒中加入TE（使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng，据此确定加入TE的量；TE 10mMTris-HCl1mMEDTAPH=8.0），一般为（1μg质粒加20μL TE；2μg质粒加50μL TE；5μg质粒加100μL TE）；
2.将质粒与TE混匀，吸取2μL混液与感受态细胞混匀，放入冰盒中，冰浴30min；
3.迅速转移至42℃水浴热激90s，随后冰浴2min；
4.拿出后取200μL的LB无抗液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中，37℃恒温195rpm振荡培养约45min；
5.取出离心（3000rpm；2min)，去掉200μL的上清，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL悬液涂于抗性平板；【先将对应抗性的平板放入培养箱（37℃）中预热20min】
6.把平板放入37℃培养箱，过夜培养12-16h。
（2）挑取2-3个含质粒pET28TEV-LbCasl2a单菌落接种到含有kanR抗性的10mL液体LB摇管中，37℃195rpm震荡培养12-16h,测OD0.4-0.6；PCR鉴定各管单菌落中是否存在靶基因，从阳性管取700μL悬液加入到100μL保种甘油（C=80%）中，振匀，放入-20℃冰箱保存。
（3）将含表达用载体的工程菌株复苏后，按发酵体积1%转接种子液至相同抗性的500mLLB培养基中，37℃ 180rpm震荡培养2-3h，至菌液OD600值为0.4-0.6；
（4）添加IPTG至终浓度为0.2mM,16℃、220rpm低温诱导培养12-14h；
（5）诱导结束，4℃、9000rpm、5min离心，弃上清，收集菌液；
（6）使用1x binding buffer清洗菌液备用。
3.1.2.2 Cas12a蛋白的纯化
（1）将清洗后的菌液用1x binding buffer缓冲液重悬，充分混合；
（2）使用超声破碎仪破碎菌体20min，超声3s,间隔5s；
（3）待菌液清亮时，破碎结束，4℃、12000rpm、30min离心，取上清重复上述离心操作，所有试剂菌需要0.22m除杂；
（4）将上述过滤后的上清加入到已活化的Ni柱中；
（5）向上述Ni柱加入1x washing buffer缓冲液洗脱杂蛋白，最后使用Elute buffer洗脱目的蛋白，并收集洗脱后的缓冲液；
（6）取适量上述不同梯度洗脱后的缓冲液，加入5x Protein Loading buffer,95℃变性，20min后使用SDS-PAGE电泳检测，确定纯化效果；（Cas12a100-150 149.5；M蛋白标记物10-250kD） 超滤置换洗脱液后，用BCA法定量蛋白浓度。
（7）将上述确定含有目的蛋白的缓冲液透析去除高浓度的咪唑，加入甘油至终浓度50％，分装后存储于-80℃保存。
3.1.3 crRNA的设计与制备
于牛疱疹病毒上游引物距离3’端2-7nt处插入PAM“TTTN”，由此获得的扩增产物含有富T的PAM“TTTN”，将扩增产物PAM下游25nt长度序列作为前间隔序列，据此设计crRNA序列，并送往公司合成。后续实验中Cas12a蛋白可在crRNA的引导下，特异性识别牛疱疹病毒DNA扩增产物富含T的PAM“TTTN”，并在其下游18 nt处(正链)与23 nt处(负链)对双链DNA进行切割，形成5nt的黏性末端，激活Cas12a蛋白对荧光探针的反式切割。
3.1.4 牛疱疹病毒核酸的引物设计及扩增
利用已建立的牛疱疹病毒PCR检测程序扩增牛疱疹病毒核酸，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，紫外成像仪下观察PCR扩增产物条带在凝胶中的位置，以DNA Marker为参照物，判定结果以确定核酸扩增阶段的准确性和稳定性。
上下游引物为：
BHV-1-F：AAGCGCAAAAACGTGTG（PAM“TTTN”距离3’端2-7nt）
BHV-1-R：TGCAGGTACAGCTTGGC
目的基因大小：323bp
程序设定：95℃5min 94℃30s 55℃1min 72℃1min 35cyc
3.1.5 CRISPR/Cas12a基因标记技术检测扩增产物
于NEB buffer缓冲液中加入250nM Cas12a蛋白、500 nM合成的crRNA, 1L待测DNA、500nM核酸探针（HEX-N12-BHQ1)和10U RNase酶抑制剂共20L反应体系37℃作用15min,98℃加热2min后停止反应，并用 Varioskan Flash（来自Thermo Fisher Scientific）在556nM处检测荧光信号。
3.1.6 PCR-Cas12a法敏感性和特异性试验
提取牛疱疹病毒DNA进行10倍梯度稀释，取不同稀释度的DNA（原液、10-1～10-5稀释）进行PCR反应，每个梯度做 3 个重复。取PCR产物同时以PCR-Cas12a法和凝胶电泳法进行检测；同样稀释牛疱疹病毒DNA至106～1拷贝/L，分别以PCR-Cas12a和 Real-time PCR进行检测，比较三者的敏感性差异。
提取牛疱疹病毒及对照菌株DNA，采用PCR-Cas12a方法进行检测，研究该方法的检测特异性。
3.1.7 临床样本验证
收集并提取疑似牛疱疹病毒样本的DNA，同时以PCR-Cas12a和 Real-time PCR进行检测，Real-time PCR以CT值≤35判定结果为阳性，比较2种方法对临床样本检测的一致性。
3.2 技术路线
3.3 实验方案可行性分析
3.3.1 本课题设计以前期阅读专业文献和积累实验技能为基础，专业知识与实践经历结合给实验开展带来依据和帮助。
3.3.2 指导老师理论知识和实践经验非常丰富，为此次实验提供切实可行地技术指导与保障依靠。
3.3.3 于南京农业大学OIE参考实验室开展实验，具备实验所需的仪器设备、菌种、引物、试剂、溶液、试剂盒等。
4. 研究创新点
crispr/cas12a基因编辑体系的建立可利用已建立的牛疱疹病毒pcr技术进行核酸扩增，以牛疱疹病毒1型作为示范菌株，建立敏感性高、特异性强、耗时短、成本低、可靠有效的牛疱疹病毒检测方法；
可将crispr/cas12a基因编辑体系应用于其他双链dna病原的检测中以扩大病原检测范围；
5. 研究计划与进展
2020年1月6日-2月23日：查找文献,完成专业文献综述。
2020年2月24日-3月9日：完成毕业论文选题。
2020年3月10日-3月13日：课题申报。2020年3月14日-3月23日：撰写开题报告，确定实验安排。
