1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
从dna转录出来的mrna在dcl rna酶的作用下加工变成茎环结构的前体mirna,再加工成为成熟的mirna,长度约20-24nt[1]。成熟的mirna和ago（argonaute）蛋白形成rna介导的沉默复合体（risc)[2]，再与mrna结合，在种子区切割特定的靶基因，抑制或者减少靶基因的表达，所以mirna虽然是非编码rna但在植物的后转录调控中起了重要作用[3]。
一直以来水稻是我们赖以生存的粮食源泉，前人研究发现mirna在水稻的营养代谢和逆境调控过程中起了非常重要的作用。mir159通过促进细胞分裂来调节茎、叶、籽粒的生长，进而影响器官的大小[4]。在种子萌发的过程中，mir164c and mir168a 可以调控一些和细胞通透性有关的基因，从而根据外界环境条件加速种子的萌发或者延迟萌发[6]。mir528主要通过调控osrfi2基因的表达来调控长日开花[8]。在逆境调控方面，过表达mir529a可以抑制和sod、pod有关的基因的表达，所以增强水稻的抗氧化能力[11]。通过调节逆境相关的转录因子的活性，mir528可以增强水稻对低温的耐受性。mir319可以调节乙烯的分泌来调节水稻的耐盐性。总而言之，mirna在营养生长、生殖生长等方面起了至关重要的后转录调控作用[8]。
目前降解组测序广泛的被使用起来[9]，降解组测序的核心依据是——在植物体内绝大多数的mirna是利用剪切作用调控靶基因的表达，且剪切常发生在mirna与mrna互补区域的第十位核苷酸上[10]。靶基因经剪切产生二个片段，5' 剪切片段和3' 剪切片段。其中3' 剪切片段，包含有自由的5' 单磷酸和3' polya尾巴，可被rna连接酶，连接产物可用于下游高通量测序;而含有5' 帽子结构的完整基因，含有帽子结构的5' 剪切片段或是其他缺少5' 单磷酸基团的rna是无法被rna酶连接，因而无法进入下游的测序实验;对测序数据进行深入地比对分析，可以直观地发现在mrna序列的某个位点会出现一个波峰，而该处正是候选的mirna剪切位点[11]。利用降解组测序，科研人员摆脱了生物信息学预测的限制，真正从实验中找到了mirna的作用靶基因。
2. 研究的基本内容和问题
1、借助geo数据库中的水稻（oryzasativa）不同组织(叶、幼穗、幼苗、根和花序)和不同生长阶段（营养生长和生殖生长）的降解组数据来绘制水稻mirna分布的图谱，并且寻找一些组织特异的以及保守的mirna,
2、通过go、kegg分析来解释具体调控的靶基因的生物学功能，希望能为具体的实验研究提供帮助。
3、用降解组数据和small rna测序结果对于来寻找这些表达与切割不完全一致的mirna, 希望能够进一步揭示mirna复杂多样的调控网络关系。
3. 研究的方法与方案
1、在ncbi geo (gene expression omnibus, http://www.ncbi.nlm.nig.gov/geo)和sra(sequence readarchive, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)数据库下载水稻不同组织的small rna和降解组测序数据。
2、在mirbase(http://www.mirbase.org)下载oryza sativa的成熟mirna序列，通过在线的psrnatarget service(http://plantgrn.noble.org/psrnatarget/)软件预测mirna的靶基因。
3、对数据库下载下来的数据进行格式转换、去接头、均一化处理，再用bowtie将序列匹配到水稻的基因组和第二步预测出来的靶基因上。这样就能找到mirna-靶基因一对一的关系。
4. 研究创新点
1、在实验手段方面，目前国内外学者都是研究某一种特定处理（如干旱、盐胁迫等）或者某一个特定组织器官（如花序、根等）中mirna起的调控作用。但是不同的mirna在不同的生育期、组织的表达和切割效率是随着时间发生变化的。例如，水稻在生殖生长阶段表达更多的mir166，因为mirna166与金属离子cd的积累和耐受性相关。而然关于mirna在完整的水稻生育周期、组织器官系统的分布的研究很少，所以我们期望借助geo数据库中的水稻（oryza sativa）不同组织(叶、幼穗、幼苗、根和花序)和不同生长阶段（营养生长和生殖生长）的降解组数据来绘制水稻mirna分布的图谱，并且寻找一些组织特异的以及保守的mirna,再通过go、kegg分析来解释具体调控的靶基因的生物学功能，希望能为具体的实验研究提供帮助。
2、在生物信息大数据分析方面，以往研究都是使用smallrna测序结果来分析mirna的作用，测到的reads越多表明mirna起的作用越大，但是small rna测序结果只能代表mirna的表达量，而mirna的主要功能在于切割。所以我们猜测在水稻中存在一些表达量很高但是切割效率很低以及表达量很低但是切割效率很高的mirna。降解组测序的核心是mirna与mrna互补区域的第十位核苷酸上（种子区）互补然后进行切割，测序结果会发现mrna序列的某个位点会出现一个波峰，而该处正是候选的mirna剪切位点，所以我们通过用降解组测序数据来寻找mirna真正发生切割的效率。期望用降解组数据和small rna测序结果对于来寻找这些表达与切割不完全一致的mirna, 希望能够进一步揭示mirna复杂多样的调控网络关系。
3、在预测分析过程中，会出现一些不属于水稻的mirna,这让我们进一步思考mirna的跨界调控，探究这样一种互作模式在生理上起的作用。
5. 研究计划与进展
2019年10月 和导师商量讨论、确认具体课题。阅读相关文献，学习降解组的测序原理，mirna的产生、作用机制和国内外现有的研究手段、发现和不足。
2019年10月——2019年11月 在ncbi数据库下载水稻不同组织的降解组和small rna测序数据，并且进行归纳整理。同时学习熟悉linux操作系统和用python编写简单的脚本。
2019年11月——2019年12月 熟悉并且能够独立的在服务器上完成small rna和降解组数据分析的流程。学习bowtie序列比对算法的原理和代码操作。
