1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、本课题的意义
在花粉管极性生长的过程中，在高尔基体合成的多糖以及细胞壁合成相关的酶类通过囊泡运输至花粉管顶端，以保证花粉管的快速生长[1]。在这期间，一系列蛋白质的正确互作确保着囊泡运输的正确进行。囊泡行使物质运输的功能需要经历出芽、运输、拴系、融合[2]，其中的拴系事件由各种拴系复合体介导。拴系复合体与其他各种蛋白质的正确互作是正常囊泡运输的前提。目前，在植物中已经鉴定出来的拴系复合体有exocyst复合体、cog复合体(conserved oligomeric golgi complex, cog)等。然而，目前这些复合体对囊泡拴留的具体分子机制仍不清楚。
cog复合体是一个八亚基复合体，在酵母以及哺乳动物中保守，参与调控高尔基体囊泡的逆向运输和定位[3]。本实验室前期通过免疫沉淀-质谱发现，cog拴系复合体存在与转录控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein, tctp)的互作。tctp是一类进化高度保守的蛋白质，参与调控生长、细胞增殖分化等生理过程。植物tctp具有多种生理功能：信号应激反应、抗逆境胁迫、调节生长发育以及抗病虫害等[4]。在拟南芥中，tctp与cog3、cog8均具有相似的花粉管异常的表型。我们将通过进一步确认tctp与cog复合体的互作关系，来揭示在囊泡拴系过程中二者的关系。
2. 研究的基本内容和问题
1、研究目标
基于实验室前期发现的cog复合体与tctp存在的可能的互作关系，进一步确认二者的互作关系。
2、研究内容
3. 研究的方法与方案
1、研究方法
（1）构建TCTP-Cluc载体并转化GV3101农杆菌，将农杆菌注射烟草表皮细胞瞬时表达蛋白，通过LCI进行互作验证；
（2）构建TCTP-HIS与COG3-GST表达载体，表达并纯化TCTP-HIS与COG3-GST融合蛋白，结合GST pull-down确认二者的互作关系；
（3）遗传学方法探究TCTP1与COG互作的生物学意义。
2、技术路线
3、实验方案
3．1萤火虫荧光素酶互补（LCI）实验
（1）将构建好的载体分别转化GV3101农杆菌。
（2）农杆菌注射烟草表皮瞬时表达蛋白。
1）将农杆菌接种至5mL LB(含50μg/mL Rif和50μg/mL Km)液体培养基28℃220rpm过夜培养。
2）用紫外分光光度计分别测量菌液的OD600值。
3）分别取适量的菌液混匀，室温下3000rpm离心5min，尽弃上清，用处理液重悬清洗沉淀，离心，尽弃上清。用适量的转化处理液将菌体沉淀重悬，使各菌的理论OD600值最终在0.1左右。
转化处理液配制（10mL）：取200μL0.5M的MES，200μL1M的MgCl2，10μL100mM的乙酰丁香酮，加ddH2O定容至10mL。避光（现配现用）。
4）室温避光静置3h。
5）取生长5-6周的本生烟，用去掉针头的注射器吸取处理好的菌液，轻轻按在
叶片背面，缓慢将菌液注射整个叶片。
6）烟草正常培养2-3天后，在叶片背面均匀喷洒荧光素酶底物，室温避光10min然后取下叶片，背面朝上放置，利用Tanon5200Multi全自动化发光分析系统采集图片，并做添加伪彩处理。
3．2GST Pull-down
（1）GST融合蛋白的表达与纯化
1）培养基与溶液的配制
TB（Terrific Broth）培养基（1L）：取12g胰蛋白胨、24g酵母提取物和8mL50%甘油，溶于850mLddH2O，定容至900mL，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，加入盐溶液（取12.5g K2HPO4和2.3g KH2PO4溶于100mL ddH2O，过滤除菌），待用。注意：勿将盐溶液与培养基一起高压灭菌。
Lysis Buffer（100mL）：
| 10mL | 10×PBS（终浓度为1×PBS） |
| 2mL | 0.5M EGTA PH8.0（终浓度为10mM EGTA） |
| 2mL | 0.5M EDTA PH8.0（终浓度为10mM EDTA） |
| 0.5mL | 20%Tween20（终浓度为0.1%Tween20） |
| 10mL | 5M NaCl（终浓度为0.5M NaCl） |
加ddH2O至100mL。
Wash Buffer（500mL）：
| 50mL | 10 ×PBS（终浓度为1×PBS） |
| 2.5mL | 20% Tween20（终浓度为0.1%Tween20） |
| 50mL | 5M NaCl（终浓度为0.5M NaCl） |
加ddH2O至500mL。
Elution Buffer（10mL，现配现用）
| 0.5mL | 1M Tris-HCl pH8.0（终浓度为50mM Tris-HCl） |
| 0.03g | glutathione（终浓度为10mM glutathione） |
| 0.3mL | 5M NaCl（终浓度为150mM NaCl） |
| 9mL | ddH2O |
待glutathione完全溶解后，调pH到8.1（需要约250μL 2M NaOH）
1M DTT配制：称取3.09g DTT溶于20mL的0.01M NaOAc（pH5.2），0.22μm滤膜过滤除菌，分装后于-20℃保存。
0.1M Benz-HCl配制：取0.24gBenz-HCl溶于20mLddH2O，分装，-20℃保存。
0.1M PMSF：取0.174g PMSF溶于10mL异丙醇，分装，-20℃保存。
2）实验步骤
①将GST融合表达载体转化大肠杆菌rosetta2感受态。
②挑取单菌落，接种到5mL LB（含100μL/mL氨苄青霉素）的试管中37℃210rpm摇菌过夜。
③取1mL过夜培养的菌液接种到500mL TB（含100μL/mL氨苄青霉素 34μL/mL氯霉素）中，37℃210rpm摇菌培养，至OD600值为2-3（大概需要5h左右）。将摇床温度调至18℃，继续摇菌培养45min。
④加入1.2mL的IPTG溶液（0.1M母液）至终浓度0.24mM。18℃210rpm摇菌过夜培养（12-16h）。
⑤收集菌液，4℃6000rpm离心15min，弃上清。用40mL Lysis Buffer（使用前加1mM PMSF和1mM Benz-HCl）重悬菌体沉淀（冰上操作），加入2mL的20mg/mL的溶菌酶，冰上孵育20min。
⑥超声破碎：50%振幅，工作时间20s，间歇时间40s，总共工作时间为20min（根据破碎效果可适当调整）。超声破碎结束后向裂解液中加入10mM DTT。
⑦4℃14000rpm离心30-45min。将裂解液上清转移至新的50mL离心管中，加入预先平衡的谷胱甘肽琼脂糖凝胶（取1mL 50%谷胱甘肽琼脂糖凝胶加入40mL Lysis Buffer，清洗一次，4℃1000g离心2min，弃上清）。4℃旋转摇床孵育1-2h。
⑧4℃1000g离心2min，弃上清（尽量避免损失琼脂糖凝胶），加入50mL Wash Buffer，4℃旋转摇床上清洗10min，重复2次（共洗3次）。
⑨4℃1000g离心2min，尽弃上清。加入500μL Elution Buffer，4℃旋转摇床孵育10min，离心收集洗脱液，重复洗脱1次（共2次）。最后得到约1mL洗脱的蛋白溶液。
⑩将透析袋置于预冷的透析液（1×PBS，1L）中浸泡15min，吸取适量的透析液注入透析袋，检验透析袋是否有破损，确认透析袋完好之后，将蛋白溶液注入透析袋，并用夹子夹紧两端。置于4℃透析过夜（磁力搅拌器上缓慢搅动），透析结束后，将蛋白分装并用液氮速冻，放80℃保存。
（2）His融合蛋白的表达与纯化
1）溶液的配制
Lysis Buffer（100mL）：
| 10mL | 500mM Na-phosphate pH8.0（终浓度为50mM） |
| 1mL | 1M imidazole（终浓度为10mM） |
| 0.75mL | 20%Tween20（终浓度为0.1%Tween20） |
| 6mL | 5M NaCl（终浓度为0.3M NaCl） |
加ddH2O至100mL。
Wash Buffer（500mL）：
| 50mL | 500mM Na-phosphate pH8.0（终浓度为50mM） |
| 2.5mL | 20%Tween20（终浓度为0.1%Tween20） |
| 30mL | 5M NaCl（终浓度为0.3M NaCl） |
| 5mL | 1M imidazole（终浓度为10mM） |
加ddH2O至500mL。
Elution Buffer：
| 50mM | Hepes pH7.6 |
| 1mM | EDTA |
| 1mM | MgCl2 |
| 100mM | KCl |
| 5% | glycerol |
| 250mM | Imidazole |
调pH至7.6
2）实验步骤
①转化Lobstr表达菌株，挑取单菌落，接种到5mL LB（含50μL/mL卡那霉素）小摇，转接800μL至500mL TB培养基（含50μL/mL卡那霉素霉）中，37℃210rpm摇菌培养约5h，至OD600值为2-3，将摇床温度调至18℃，继续摇菌培养45min，然后加入IPTG至终浓度0.24mM。18℃210rpm摇菌过夜培养。
②4℃600rpm离心15min集菌。用40mL Lysis Buffer（含有1mM PMSF和2mM Benz-HCl）重悬菌体沉淀（冰上操作），加入2mL的20mg/mL的溶菌酶，混匀，4℃孵育20min。
③超声破碎：50%振幅，工作时间20s，间歇时间40s，总共工作时间为2min（根据破碎效果可适当调整）。超声破碎结束后向裂解液中加入10mM（约35μL）β-巯基乙醇。
④4℃14000rpm离心30-45min。
⑤吸取800μL Ni-NTA Agarose（50% slury），用50mL Lysis Buffer清洗，2000rpm离心2min，备用。
⑥将裂解液上清与清洗后的Agarose混匀，然后4℃旋转摇床孵育2h。
⑦4℃1000g离心2min，弃上清。用50mL Lysis Buffer漂洗3次。
⑧将Agarose转移到1.5mL EP管中。加入500μL Elution Buffer，4℃旋转摇床孵育10min，离心收集洗脱液，重复洗脱1次（共2次）。最后得到约1mL洗脱的蛋白溶液。
⑨将透析袋置于预冷的透析液（1×PBS，1L）中浸泡15min，吸取适量的透析液注入透析袋，检验透析袋是否有破损，确认透析袋完好之后，将蛋白溶液注入透析袋，并用夹子夹紧两端。置于4℃透析过夜（磁力搅拌器上缓慢搅动），透析结束后，将蛋白分装并用液氮速冻，放80℃保存。
（3）GST Pull-down
1）溶液的配制
Binding Buffer：1×PBS，0.1% Triton X-100，使用前加入1mM DDT，Cock-Tail蛋白酶抑制剂，冰上放置。
Wash Buffer：1×PBS，0.5% Triton X-100，使用前加入1mM DDT，Cock-Tail蛋白酶抑制剂，冰上放置。
Elution Buffer（10mL，现用现配）：
| 0.5mL | 1M Tris-HCl pH8.0（终浓度为50mM Tris-HCl） |
| 0.03g | glutathione（终浓度为10mM glutathione） |
| 0.3mL | 5M NaCl（终浓度为150mM NaCl） |
| 9mL | ddH2O |
待glutathione完全溶解后，调pH到8.1（需要约250μL 2M NaOH）
2）实验步骤
①分别取30μL谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠（50%悬液）于2个1.5mL EP管中，1000g 4℃离心2min，小心吸去上清。
②分别向每管中加入1mL Binding Buffer清洗琼脂糖凝胶珠，离心去上清，放置于冰上待用。
③分别向两管中加入10μg的GST（对照组）和GST融合蛋白，加入Binding Buffer将每管液体总体积补足400μL，4℃旋转摇床孵育1-2小时。
④离心，弃上清，用1mL Wash Buffer清洗凝胶珠。
⑤向每管中加入5μg的His融合蛋白，用Binding Buffer补足400μL。
⑥4℃旋转摇床孵育2h。
⑦离心，小心吸尽上清，尽量避免吸到琼脂糖凝胶珠，用1mL Wash Buffer清洗凝胶珠，重复3次（共4次）。
⑧清洗完最后一次，4℃1000g离心2min，尽弃上清。加入100μL Elution Buffer，轻轻振荡混匀5min，离心收集洗脱液。
⑨加入25μL的5×上样缓冲液，95℃煮5min，冷却后各吸取30μL进行Western blot检测。
4. 研究创新点
特色或创新之处
tctp与cog3、cog8突变体均具有相似的花粉管生长异常的表型，并且结合本实验室前期的工作来看，在生理条件下很可能存在TCTP与COG复合体的互作关系，但是目前尚没有文献报道该互作关系。因此，本课题是第一次揭示TCTP与COG复合体的互作，进一步完善了在花粉管生长过程中蛋白质的互作关系。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2019年9月-2019年12月：完成cluc、nluc以及tctp-his、cog3-gst载体的构建与测序工作。
2020年1月：完成萤火虫荧光素酶互补（lci）实验。
