1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献）
蚯蚓和丛枝菌根真菌是农田生态系统中具有广泛分布且数量丰富的两大土壤有益生物类群[1]。蚯蚓是农田土壤中最为重要的分解者之一，通过取食，消化，排泄和掘穴等一系列生命活动，蚯蚓能加强氮素矿化，促进土壤氮素循环[2]。am真菌能与作物根系形成密切的共生关系，对土壤氮素循环起着重要的调控作用，可促进氮素的吸收和矿化，影响硝化和反硝化过程，降低氮素淋失等[3]。
虽然蚯蚓与am真菌处于不同的营养级，且不存在捕食关系，但是二者并不独立，通过相互作用，在农田系统中发挥一系列重要生态功能[4]。研究发现，蚯蚓矿化土壤有机质以增强土壤氮磷养分的有效性，am真菌进一步促进作物对氮磷养分的吸收，从而表现出互补效应[5]。蚯蚓能显著提高玉米的菌根侵染率和根外菌丝密度，并改变根内am真菌的群落组成；这可能是由于蚯蚓排泄物含有植物激素而促进菌丝侵染及其共生功能[6]。蚯蚓 -菌根互作能够增加土壤微生物多样性和碱性磷酸酶活性，从而提高玉米对有机磷和磷酸钙的吸收利用效率[7]。通过调控土壤有机碳、微生物量c、n和p，磷酸单酯酶和脲酶活性等生化因子，蚯蚓-菌根互作能够增加土n、p有效性， 从而促进玉米n和p的吸收和植株生长[8]。同时也有研究发现，蚯蚓-菌根互作对土壤碳氮含量具有协同作用[9]。因此蚯蚓-菌根互作可能改变土壤碳氮磷的化学计量关系，从而对氮素循环起着重要的调控作用。
2. 研究的基本内容和问题
1、研究目标
阐明不同秸秆还田方式下稻茬麦田am真菌群落对蚯蚓活动的响应特征。
2、研究内容
3. 研究的方法与方案
1、研究方法及技术路线
处理 | CK | RTSR | DBSR |
E | CK E | RTSR E | DBSR E |
-E | CK-E | RTSR-E | DBSR-E |
（注：试验在大田条件下进行，采用裂区设计，秸秆还田为主区，蚯蚓处理为副区。
秸秆还田方式：免耕不还田（CK),粉碎旋耕还田（RTSR),集中沟埋还田（DBSR)
蚯蚓处理：接种（ E）和不接种（-E），每个处理重复三次）
2、实验方案
在大田条件下，采用裂区试验设计，其中，秸秆还田方式为主区，蚯蚓处理为副区。秸秆还田方式为3个水平：空白对照(免耕不还田；CK)、常规粉碎旋耕还田(稻秸粉碎长度为5cm；旋耕深度为10cm；RTSR)、新型集中沟埋还田(埋深20cm； DBSR)。蚯蚓分为2个水平：不接种(-E)和接种( E)。秸秆做全量还田处理。共6个处理：CK-E，CK E，RTSR-E，RTSR E，DBSR-E和DBSR E，每个处理重复3次，共有3*2*3=18个小区。小区面积为0.5m*0.5m=0.25m2。蚯蚓取自当地试验田，在小麦分蘖期接种，接种密度为 40 条/m2(依据前期田间调查数据确定)。为防止接种蚯蚓逃跑及外界蚯蚓进入，用PVC板制作 0.55m (长)*0.5m(宽)*0.5m (深) 的无底长方体装置，在装置外套两个100目的网袋，取出田间原位土体置于其中，作为一个试验小区嵌入田中，试验装置四周塑料薄板露出地表5cm，并于内外沿缠上粘扣带 (参照Lubbers etal. (2013)的方法)。为测定菌根功能，设计3cm (直径)*25cm (高度) 柱状特有装置， 装置四周开三个直径2cm的窗口，并用30m尼龙膜封住。柱状装置掩埋于试验小区土壤，顶端漏出5cm。每个小区按对角线安装5个柱状装置，并装满灭菌田间原位土壤。在管子中施加用15N标记的尿素作为孕穗肥。
在成熟期取样。按五点取样法取土样；植株样 (根、茎及叶) 按小区对角线取9棵植株进行混合。
测定指标：
AM真菌群落组成与多样性、侵染率、孢子密度、菌丝密度、植株生物量、氮磷含量、15N含量。
测定方法：
（1）AM真菌群落组成及多样性解析 根样 DNA 提取利用植物基因组DNA提取试剂盒 (上海生工，中国)。经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法检测基因组DNA质量可靠后，送至上海美吉生物公司利用Illimina Miseq平台进行高通量测序。本研究拟使用AMV4.5NF-AMDGR作为测序引物，目标DNA片段长度300bp左右 (van Geel etal.2014)，满足Illimina Miseq测序平台的要求。
测序引物分别为：
AMV4.5NF (F)：5-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3；AMDGR (R)：5-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3。
使用Mothur v.1.33.0 软件分析Illimina Miseq高通量测序数据 (http://www.mothur.org/wiki/Main_Page.html）以utoff值0.03 (即 97%序列相似性)进行划分OTU (Operational taxonomic unit)。AM真菌群落组成使用NMDS (Non-metric multi-dimensional scaling) 排序方法进行分析； AM真菌多样性使用Shannon-Weinner指数及Faiths PD进行表征。（2）根外菌丝密度测定：采用改进的水相提取-滤膜法 (Jakobsen etal. 1992)。菌丝长度采用改进的Newman方程进行计算 (Tennant 1975)。
（3）菌根侵染率测定：采用方格交叉法 (Giovannetti Mosse 1980)。侵染率=交叉点上的菌根数/根段与方格线交叉点数100%。
（4）AM 真菌孢子密度测定：采用湿筛倾析法分离孢子 (Gerdemann Nicolson1963)。以单位重量干土孢子数量来表征。
（5）球囊蛋白含量测定：采用改进的Wright和Upadhyaya方法，分别测定易提取球囊蛋白(easily-extracted glomalin-related soil protein, EE-GRSP)和总球囊蛋白(total glomalin-related soil protein, T-GRSP)。将0.5g土样 121摄氏度高压灭菌30min，溶于4ml 20mM柠檬酸缓冲液(pH7.0)，上清液即为EE-GRSP。将0.5g土样121摄氏度高压灭菌1h，溶于4ml 50mM柠檬酸缓冲液(pH8.0)，上清液即为T-GRSP。EE-GRSP和T-GRSP的含量通过Bradford法进行测定(Wright Upadhyaya1996)。
（6）植株N含量测定：采用凯氏定氮法测定《土壤农化分析第三版》 (鲍士旦，2000)。
（7）植株P含量测定：采用钼锑抗吸光光度法测定《土壤农化分析第三版》 (鲍士旦，2000)。
（8）植株15N含量测定：采用同位素质谱仪测定。（9）土壤理化性质测定：参照测定《土壤农化分析第三版》 (鲍士旦，2000)。测土壤pH时，按水土比5:1充分混匀，沉淀至溶液澄清，用pH计测定。土壤有机质测定采用浓硫酸-重铬酸钾氧化法。土壤总氮含量测定采用凯氏定氮法。总磷和速效磷测定采用钼锑抗比色法。NH4 -N和NO3--N浓度测定采用流动分析仪。
3、可行性分析
（1）研究选题及实验设计可行
本研究旨在探究不同秸秆还田方式下蚯蚓对AM真菌群落组成及功能的影响。秸秆还田为蚯蚓提供充足的食物来源，而蚯蚓的取食与活动促进秸秆源氮素矿化；蚯蚓排泄物中含有植物激素，能够促进AM真菌菌丝侵染，提高其氮素吸收转运功能。蚯蚓与菌根在植物氮素吸收利用上可能具有一定的功能互补效应，因此，在研究选题上具有可行性。
本项课题试验地点为江苏沿江农科所试验基地；南粳5055和扬辐麦4号分别为试验采用的水稻和小麦品种，蚯蚓取自周围农田，试验时期为稻茬麦田。在大田条件下，采取裂区试验设计，秸秆还田为主区，蚯蚓处理为副区。秸秆还田方式分为三个水平，包括免耕不还田（CK)，常规粉碎旋耕还田（RTSR），新型集中沟埋还田（DBSR）；蚯蚓分为两个处理，接种（ E）和不接种（-E）。每个处理三个重复。在小麦成熟期对各个处理中AMF的群落组成，AMF的群落功能和AMF的活性进行测定。故在实验设计上具有可行性。
（2)前期研究基础良好
申请人指导老师所在课题组近十年来一直在从事秸秆还田和农田温室气体排放的相关研究，研究技术体系相对成熟。课题组承担过国家科技支撑计划、农业部公益性行业科研专项、国家自然科学基金和江苏省自然科学基金等多项科研项目。具有长期定位大田试验研究基地，并且已经开展了9年秸秆集中沟埋还田新型土壤耕作技术研究，形成了特殊的土壤生态体系，为本研究大田试验的顺利开展奠定了坚实基础。
（3）项目团队具有该领域良好的研究背景
申请人的指导教师与其他项目成员长期从事土壤微生物生态及农田生物多样性等方面的研究，熟练掌握相关研究技术，具有较好的研究基础。课题组成员以中青年为主，研究背景涉及生态学、土壤学、作物栽培与耕作学等，优势互补，能够保证本项研究顺利完成，达到目标要求。
4. 研究创新点
特色或创新之处
作为农田土壤系统中两大主要功能生物类群，蚯蚓与AM真菌的生态互作关系长期受到忽视。本项目以广泛分布于长江流域的稻麦两熟制为研究对象，阐明不同秸秆还田方式下，稻茬麦田蚯蚓活动对AM真菌群落结构及功能的影响。研究结果将丰富生物多样性知识理论体系。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
1、研究计划
项目预计在一年内完成。
