1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 课题意义
肾素－血管紧张素系统（renin-angiotensin-system，ras）是主要的体液调节系统，由一系列酶促反应组成。其主要功能是调节机体血压、水分、电解质和保持机体内环境的稳定性。多年的研究发现ras既存在于循环系统中，也存在于血管壁、心脏、中枢、肾脏和肾上腺等组织中，共同参与对靶器官的调节。
血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme 2, ace2）是2000年发现的对ras系统起负调节作用的关键酶。在过去的十几年里，人们对它作为机体蛋白角色的了解呈指数增长。研究发现ace2在体内分布上有一定的组织特异性，多表达于心脏、肾脏、肺部、消化系统（包括胰、胃和肠道）和生殖系统[1]。
2. 研究的基本内容和问题
1 研究目标
以不同日龄猪的十二指肠、空肠和回肠为样本，研究不同日龄猪肠道ace2 mrna和蛋白表达的差异性变化。
2 研究内容
3. 研究的方法与方案
1. 研究方法
1）试验动物及样品采集
选用适当日龄仔猪，经放血处死后采取小肠组织，进行低温保存。
2）引物设计与合成
根据GenBank上公布的基因序列由Primer Premier 5自行设计引物，并委托生物科技公司合成。
3）肠道各组织总RNA提取和反转录
采用Trizol抽提法，紫外比色法等分子生物学技术。
4）ACE2的PCR扩增及电泳鉴定
以cDNA为模板进行RT-PCR扩增。
5）不同日龄仔猪胃肠道各组织ACE2 Real-time PCR定量鉴定
对上述cDNA进一步采用Real-time PCR Sybr-Green染料法进行ACE2相对定量分析。
6）相关数据分析及图表绘制
各样本结果均用其相应的GADPH标化，用相对定量2-△△ CT法进行数据统计。
采用SPSS16. 0统计软件进行统计分析，差异显著性检验采用独立样本t检验和单因子方差分析（One way ANOVO, LSD）。所有数值以平均值标准误表示。
（1~6具体见实际操作）
2. 技术路线与实验方案
刚出生的健康猪仔 |
不同日龄宰杀（3日龄、90日龄、120日龄） |
空肠（前段、中段、后段）、结肠、回肠、十二指肠 |
Western |
Real-time PCR |
ACE2表达 |
ACE2 mRNA定量分析 |
ACE2表达与肠道发育关系的分析 |
3. 可行性分析
本实验依托南京农业大学动物医学院寄生虫教研组大量的科研数据，以及专家论证，具有很高的研究价值和可行性。
4. 研究创新点
目前ACE2的研究对象主要是人和鼠，所有的研究主要侧重于人医临床。ACE2在动物方面的全面研究还没有开始，尤其是在猪肠道方面的研究尚没有报道。本研究首次以不同日龄的猪为对象，在基因和蛋白水平上进行相对定量，明确ACE2在猪肠道内的分布和表达情况，揭示ACE2对猪肠道的营养吸收、仔猪腹泻等相关生理或病理作用为本项目的创新之处。
5. 研究计划与进展
本本研究计划用半年时间完成，具体安排如下：
2016.09-2019.10 完成样品采集、试剂联系、引物设计等工作。
2016.10-2016.11 完成生化指标的测定。
