1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
牛病毒性腹泻-黏膜病病毒是黄病毒科瘟病毒属代表种，bvdv主要引起牛的病毒性腹泻-黏膜病，表现为腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，母畜流产、死胎和畸胎等[1，2]。
在欧美各国，养牛业发展较为完善，而bvdv由于传染性强，并且不同临床症状对牛的不同生长阶段均有着较大的影响，尤其是繁殖方面的影响，导致极大的经济损失，因此近年来通过严格的检测，及时清除持续性感染牛等综合措施，bvdv得到了有效地控制。在我国，该病没有形成广泛流行，但一些学者对牛群的检测结果显示阳性率达30%，存在于二十几个省市自治区，且在易感动物群中感染有扩大趋势。由于没有完善的诊断、检测技术，目前尚缺少bvdv对养牛业经济影响的评估方法[1]。
1946年olafson等在美国纽约以消化道溃疡和下痢为特征的病牛中首先发现牛病毒性腹泻，1953年ransey 与chiver 发现了牛黏膜病，1957年首次分离到病原体，1959年，gillespie 和baker 鉴定了纽约株和印第安纳株为同一个类型的病毒。1960年gillespie 等分离到后来被定为标准毒株并用于bvd-md血清学及病毒学研究以及实验室诊断的c24v，1971年由美国兽医协会统一命名为牛病毒性黏膜病[1，3]。1980年，李佑民首次在中国从国外引进的牛的流产胎儿脾脏中分离并鉴定出bvdv，证明我国也有本病存在。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：本研究旨在通过rt-pcr扩增技术和基因拼接技术扩增获得bvdv nadl全基因序列，对全基因进行序列测序与分析。
研究内容：本研究通过nadl全基因序列分析，将全基因共分为5个片段进行扩增，利用rt-pcr技术分别扩增5个分段片段，依次将5个片段基因克隆至peasy-simple-blunt载体中，进行序列的测定，并将测定获得的序列进行全基因拼接，对全基因进行序列分析。
拟解决的关键问题：通过bvdv nadl毒株的全基因序列测序与分析为进一步深入研究bvdv致病机制奠定基础。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
首先，根据已发表的序列，参考毒株bvdv nadl{nc001461}，将基因组分为5个片段，并设计5对特异性引物。然后，从犊牛睾丸细胞上大量繁殖的细胞中提取bvdv的基因组rna，在获得bvdv基因组rna后，以它为模板通过反转录合成相应cdna 。在获得cdna片段后，以它为模板，以相应特异性引物通过rt-pcr技术对其进行扩增。将pcr产物经电泳分离纯化后进行连接克隆和转化。最后，对重组质粒进行阳性克隆的筛选和鉴定，并将鉴定为阳性的质粒送公司测序并采用软件进行拼接、分析和比较。
技术路线：
4. 研究创新点
本研究利用分子生物学和基因扩增拼接技术，扩增BVDV全长基因，并对全长基因进行拼接，为BVDV感染性克隆的建立奠定基础，为进一步深入研究BVDV致病机制具有重要意义。
5. 研究计划与进展
2016年9月~2016年12月：利用分子生物学和基因扩增拼接技术，扩增bvdv全长基因，并对全长基因进行拼接。
2016年9月~10月：完成5个片段中a1、b2两个片段的测序。
2016年10月~11月：完成5个片段中a2、b1两个片段的测序。
