1. 研究目的与意义
| 研究背景： 有机溶剂有严重破坏微生物正常生理功能的毒害作用，而细胞膜是溶剂毒性作用的主要靶点。1989年，关于菌种Pseudomonas putida的有机溶剂耐受现象的报道，开辟了人们对有机溶剂耐受机制理解的纪元。耐有机溶剂微生物是一类新颖的极端微生物，它们通过各种耐受机制，有效抵御或降低有机溶剂对其细胞产生的毒害作用，机制包括：囊泡外排、改变细胞膜磷脂结构组成、有机溶剂外排泵、改变细胞比表面积等，而其中以有机溶剂外排机制为最重要。在恶臭假单胞菌中存在的有机溶剂外排泵主要有：TtgABC、TtgDEF、TtgGHI。在恶臭假单胞菌株B6-2中有两个外排泵TtgABC和TtgGHI均参与对有机溶剂的外排。前期的研究发现当菌株失活外排泵TtgGHI以后，菌株对联苯的持续降解能力减弱，分裂能力降低。 研究目的： 本论文旨在研究外排泵缺失以后对菌株休眠的影响，探究菌株的外排泵与休眠的关系。 研究意义： 通过对外排泵TtgABC和TtgGHI的研究，可以有助于了解在不同条件下，外排泵TtgABC和TtgGHI对抵御或降低有机溶剂的毒害作用能力大小。
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2. 研究内容和预期目标
研究内容：
1.低温诱导休眠的菌株存活率；
2.寡营养诱导休眠的菌株存活率。
3. 研究的方法与步骤
| 低温诱导休眠的研究方法： 活化菌株，接种到含LB液体培养基的锥形瓶中培养至对数生长期，涂平板恒温过夜，第二天平板计数。剩余接种后锥形瓶放4℃冰箱，第二天加卡那霉素后培养，涂平板恒温培养过夜，第二天平板计数。两次计数结果相比，得菌株存活率。 步骤包括： A. 活化菌株：在超净工作台里将冷冻保藏的恶臭假单胞菌B6-2、△TtgABC、△TtgGHI接到含有5 ml LB液体培养基的摇管中，30℃摇床培养过夜活化12h。 B. 第二天将活化好的菌液按1%的接种量接到含有LB液体培养基的锥形瓶中，放在摇床里培养3h至对数生长期。 C. 将菌液分别稀释10-3、10-4、10-5三个浓度涂平板，放至30℃恒温培养箱里过夜培养，第二天进行平板计数。 D. 剩余菌液放4℃冰箱，第二天取出卡那霉素50μl，培养6h。 E. 将菌液稀释10-1、10-2、10-3三个浓度涂平板，放至30℃恒温培养箱里过夜培养，第二天进行平板计数。
寡营养诱导休眠的研究方法： A. 活化菌株：在超净工作台里将冷冻保藏的恶臭假单胞菌B6-2、△TtgABC、△TtgGHI接到含有5 ml LB液体培养基的摇管中，30℃摇床培养过夜活化12h。 B. 第二天将活化好的菌液按1%的接种量接到含有LB液体培养基的锥形瓶中，放在摇床里培养3h至对数生长期。 C. 将菌液分别稀释10-3、10-4、10-5三个浓度涂平板，放至30℃恒温培养箱里过夜培养，第二天进行平板计数。 D. 将剩余菌液分别取50ml至离心管中，5000r/min离心5min，弃上清加20ml生理盐水，重复两次。加至空锥形瓶中，常温过夜。 E. 第二天加卡那霉素10μl，30℃摇床培养6h。 F. 将菌液稀释10-1、10-2、10-3三个浓度涂平板，放至30℃恒温培养箱里过夜培养，第二天进行平板计数。
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4. 参考文献
| [1]. 吴艳霞, 熊静远, 田莲田,等. 微生物持留菌与医疗卫生[J]. 现代预防医学, 2014, 41(5):908-910. [2]. 王庆利, 何丹, 郑晓冬,等. 有机溶剂对细胞的毒害及细胞的耐受性机制[J]. 微生物学通报, 2002, 29(4):81-85. [3]. 姜昕. 细菌持留状态研究进展[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2011, 31(9):851-853. [4]. Rojas A, Duque E, Mosqueda G, et al. Three efflux pumps are required to provide efficient tolerance to toluene in Pseudomonas putida DOT-T1E[J]. Journal of Bacteriology, 2001, 183(13):3967-73. [5]. Weber F J, de Bont J A. Adaptation mechanisms of microorganisms to the toxic effects of organic solvents on membranes[J]. Biochim Biophys Acta, 1996, 1286(3):225-245. [6]. 吴培, 张毅, 许喜林. 有机溶剂对酵母细胞膜完整性的作用机制研究[J]. 食品工业科技, 2008(1):301-303. [7]宋亮, 倪晔, 孙志浩. 基于蛋白质组学的假单胞菌耐溶剂机制研究[J]. 微生物学通报, 2012, 39(4):0468-0476.1. [8]. Inoue K, Widada J, Nakai S, et al. Divergent structures of carbazole degradative car operons isolated from gram-negative bacteria[J]. Bioscience Biotechnology Biochemistry, 2004, 68(7):1467-1480. [9].Moriya K, Horikoshi K. Isolation of a benzene-tolerant bacterium and its hydrocarbon degradation[J]. Journal of Fermentation Bioengineering, 1993, 76(3):168-173. [10].Huertas M, Duque E, Marqués S, et al. Survival in soil of different toluene-degrading, Pseudomonas strains after solvent shock[J]. Appl Environ Microbiol, 1998, 64(1):38-42. [11]. 王洪涛, 王孝平, 玄光善. 有机溶剂耐受菌的研究进展[J]. 生物技术通报, 2008(5):63-66. [12]. 王鑫昕, 王少华, 李维,等. 细菌的有机溶剂耐受机制[J]. 生物工程学报, 2009, 25(5):641-49. [13] 李春荣, 王文科, 曹玉清,等. 石油污染物的微生物降解研究[J]. 应用化工, 2008, 40(1):34-37. [14] 唐啸宇, 孙洪林, 何冰芳. 耐有机溶剂微生物及酶类在生物催化中的应用[J]. 化学进展, 2009, 21(12):2726-2733.
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5. 计划与进度安排
| （1）2018年12月11日至2018年12月24日：与指导老师见面，确定论文选题； （2）2018年12月25日至2022年3月18日：接受任务书；查阅文献资料； （3）2019年3月19日至2019年4月1日（第3周~第4周）：撰写开题报告；开展外文文献翻译； （4）2019年4月2日至2019年4月15日（第5周~第6周）：设计实验方案，准备实验材料。对实验器材进行熟悉； （5）2019年4月16日至2019年5月20日（第7周~第11周）：根据任务内容做实验。做好实验过程结果记录，分析此过程数据。 （6）2019年5月21日至2019年6月10日（第12周~第14周）：整理前几周的实验数据，综合分析实验结果，与导师交流讨论实验结论，检查结果，发现错误及时补救。根据实验过程和结果撰写论文； （7）2019年6月11日至2019年6月15日（第15周）：提交数据和图表，毕业论文修改、定稿与毕业答辩。
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