醇沉条件对猴头菇多糖得率和品质的影响开题报告

1. 研究目的与意义

一、背景

猴头菇是食用菌的一种，具有极高的营养价值，以及独特的医疗保健价值。猴头菇中含有许多不同种类的生物活性成分，如多糖类和猴头菌素等。猴头菇多糖是其中最为主要的活性成分之一,也是其活性成分中研究最多的一类次生代谢产物，可以从优质猴头菇子实体中提取得到。经热水提取的猴头菇多糖对小白鼠肉瘤180和艾氏腹水癌有明显的抑制作用，同时具有助消化、利五脏的功能，对慢性胃炎、十二指肠溃疡等多种消化道疾病均有较好的疗效，能提高人体免疫能力，有助于预防、缓解或包括治疗癌症、脂血症、神经退行性疾病在内的多种疾病。

多糖提取时，无论是采用常规的热水浸提法、酸液提取法、碱液提取法，还是新型的超声波提取法、微波提取法、生物酶提取法、超滤法等，最后都要通过醇沉获取精制多糖。醇沉工艺因其具有操作过程简单、溶剂安全性高和除杂效果好等优点被广泛应用于多糖提取物的生产中。 本课题采用的是热水浸提法提取，其作用原理是利用多糖等生物有效成分溶于水而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特性，借助于热力作用使食用菌细胞发生质壁分离进行提取的方法。水作为溶剂渗入细胞壁和细胞质之中，溶解液泡中的物质，使其通过扩散作用穿过细胞壁，扩散到外部溶剂中。热水浸提法的优点在于操作工艺简单，对设备要求不高，取材方便，提取成本低，易于推广，适合用于大规模的工业化生产。但这种方法也存在一定的弊端：提取时间过长、提取温度高、消耗能源多、提取效率不高，且当浸提时间过长，还会使多糖的结构遭到破坏，从而降低多糖的生物活性。热水浸提之后得到的是猴头菇多糖的粗提物，还需要精制。 醇沉是利用多糖不溶于高浓度乙醇的物理性质来进行操作的，多糖是多羟基的醛或酮，可溶于水，但是在多糖水溶液中加入乙醇会破坏多糖水溶液中的氢键，从而降低多糖在水中的溶解度，使多糖以沉淀的形式析出。不同浓度的醇沉淀的组分不一样，一般采取分级醇沉。醇沉的时候单糖也可以被醇沉出来，醇浓度越高单糖被沉淀出来的量也会越高。醇沉的作用就是精制提取步骤中的猴头菇多糖的粗提物。很多研究显示，乙醇体积分数、醇沉时间、醇沉温度、多糖浓度、加醇速度等工艺参数会影响醇沉多糖的得率，也会影响所得多糖组分的抗氧化性等品质。因此，有必要研究这些因素对醇沉多糖得率的影响。 抗氧化研究主要是测定猴头菇多糖提取物清除羟基自由基“-OH”的能力、清除超氧阴离子自由基“O2-”的能力、清除DPPH·的能力以及还原能力。经过一系列反应之后可以根据所得样品液的吸光度，来判断猴头菇多糖提取物的抗氧化性的各项能力。 为了探寻这些因素的影响程度，我们将使用正交实验法来进行验证。正交实验法就是利用排列整齐的表 -正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果，这种试验设计法是从大量的试验点中挑选适量的具有代表性的点，利用已经造好的表格—正交表来安排试验并进行数据分析的方法。正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。二、研究目的 猴头菇在我国种植和食用均有几百年的历史，其生物活性成分的提取、功效产量提升等方面已有大量的研究报道。猴头菇具有开发成为特定的保健医疗功效的食品或药品的潜力。如何充分发挥我国猴头菇在种植资源上的优势，将现有研究成果转化为新的产品，找到高效分离猴头菇中活性成分的方法，并将其应用到医药、食品领域，是猴头菇资源开发利用的重要研究目的。三、研究意义系统地开展醇沉工艺优化研究，将有助于提高活性多糖的得率，对食药用菌多糖提取物的高效利用和质量提升具有重要的现实意义。

2. 研究内容和预期目标

本论文拟运用单因素实验和正交法对猴头菇多糖醇沉工艺的影响因素和水平进行优化，通过方差分析和直观分析确定最佳的猴头菇多糖醇沉条件，并测定所得猴头菇多糖醇沉物的抗氧化活性。

一、研究内容包括：（1）采用热水浸提法或生物酶提取法提取猴头菇多糖；（2）以猴头菇多糖得率为指标，运用单因素实验和正交实验对醇沉工艺进行优化，得到最佳的猴头菇多糖醇沉条件；（3）对猴头菇多糖的抗氧化活性进行研究。

可测定醇沉猴头菇多糖的dpph自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率等。

3. 研究的方法与步骤

一．研究方法：1、利用单因素实验分析酶浓度、酶处理温度、酶处理时间、料液比、pH等因素对猴头菇多糖得率的影响，其中包括DNS法测还原糖浓度、苯酚硫酸法测总糖浓度；2、利用正交实验，通过方差分析和直观分析，确定最优提取条件并验证；3、通过浓缩、脱蛋白（Sevage法或三氯乙酸法）、醇沉（乙醇沉淀法）、复溶等步骤精制多糖；4、测定提取得到的猴头菇多糖的抗氧化活性，其中包括对DPPH自由基的清除率（DPPH法）、对羟基自由基的清除率（显色剂褪色光度法）、对超氧阴离子自由基的清除率（邻苯三酚自氧化法）以及猴头菇多糖的还原性强弱的测定（与氧化剂反应）。二、实验步骤1、简要的实验流程 猴头菇实体粉碎过筛→石油醚脱脂→提取多糖→脱蛋白→醇沉后保存→进行多糖的抗氧化性实验→进行结果的讨论分析。2、操作步骤2.1猴头菇多糖的提取

2.1.1猴头菇的脱脂

称取猴头菇实体粉末25g，过60-80目的筛网除去大颗粒状粉末 ,按料液比 1∶ 8在250mL锥形瓶中先加入200mL石油醚再加入干粉，保鲜膜封口，放入37℃的恒温水浴震荡器中震荡12h，第二天放入离心机中4000rpm，离心15min,除去上清液，将沉淀放入60~70℃烘箱中烘干，保存备用。

2.1.2制作苯酚 - 硫酸标准曲线（以葡萄糖为标准品）（1）分别取标 准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于比色皿中；加水至2mL。再各加 2mL 5%苯酚溶液，摇匀。缓慢加入6mL浓H₂SO₄，冷却，摇匀，在波长490 nm下测定吸光度，以糖的质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。（2）称取5g猴头菇干粉，按1∶20比例在90 ℃水浴中提取3h，4000 r/min离心10 min，去滤渣得滤液，分别合并滤液及上清液，取浸提液0.1 mL，加清水至2 mL，加10%苯酚溶液2 mL，摇匀，用移液管向每支试管中缓慢加入浓H2SO4 6 mL，并放入冷水中冷却，摇匀，静置20min，在490 nm下比色测定吸光度，将测定的吸光度代入标准曲线，求被测液多糖浓度，进而求得浸提液多糖含量，并最终求得提取率。

多糖得率（%）=（总糖含量-还原糖含量）×多糖溶液体积/子实体干重×100。

2.2猴头菇多糖的精制

收集400mL的猴头菇多糖粗提液，测定其多糖浓度。

（1）浓缩：将猴头菇多糖粗提取液用旋转蒸发仪浓缩至原来体积的1/4，计算猴头菇多糖的含量与多糖回收率。多糖含量计算公式：多糖含量（mg/mL）=总糖浓度×稀释倍数-还原糖浓度×稀释倍数。

（2）脱蛋白：将浓缩后的多糖溶液放入250mL锥形瓶中，加入其1/2体积的Sevage试剂，摇晃震荡半小时左右，使猴头菇多糖蛋白质变性。在5000rpm，4℃的条件下离心15min，吸取上清液，之后重复该步骤三次，彻底脱去蛋白质。再测猴头菇多糖的含量与回收率。

（3）醇沉：采用正交实验法,以热水浸提法提取出的猴头菇粗多糖中猴头菇多糖的含量为评价指标,选择醇沉浓度、醇沉时间、醇沉温度和猴头菇多糖粗提物浓度4个影响醇沉效果的因素为考察因素。

正交实验因素水平表（各因素数值暂定，需后续实验来确定最佳的水平梯度设置）

水平		因素
A醇沉浓度/倍	B醇沉时间/ h C醇沉温度/ ℃	粗提物浓度/ g·mL-1
1	3	6	10	1/ 6
2	4	12	25	1/ 3
3	5	24	60	1/ 2

2.3结果分析

通过方差分析和直观分析，确定最优醇沉条件并验证。

2.4猴头菇多糖的抗氧化性实验

维生素C，又称L-抗坏血酸，是一种水溶性的维生素，具有较强的抗氧化作用，对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基，都有较强的清除作用，可作为对照与多糖溶液的抗氧化能力进行比较。

（1）多糖对DPPH自由基清除率的测定

原理：DPPH又称作1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，DDPH-甲醇的溶液呈紫红色，并且在波长为515nm处有强烈的吸收作用。当加入猴头菇多糖溶液后，会使溶液褪色，并且在波长515nm处的吸光度值会变小，因此，多糖对DPPH自由基的清除作用越强，吸光度值就越小。

步骤：首先配制三种不同浓度的维生素C溶液保存于试剂瓶中，放入4℃冰箱备用，用于与猴头菇多糖抗氧化能力作比较。在干净的试管中，依次加入0.1ml稀释过后的三种不同浓度的猴头菇多糖溶液，再加入3.9ml0.075mmol/lDPPH-甲醇溶液，充分摇匀后，室温放置半小时。将分光光度计的波长调节为515nm，以甲醇为空白对照，测定其吸光度值，得A₁值。另取1支干净试管，加入0.1ml甲醇与3.9ml DPPH-甲醇溶液，摇匀后室温放置半小时。调节分光光度计的波长为515nm，测定在该波长515nm处的吸光度值，得A₀值，最后计算清除率。

清除率计算公式：清除率=（A₀-A₁)/ A₀×100%

用稀释成不同浓度的维生素C溶液替换猴头菇多糖溶液，按上述步骤进行对照实验，并计算对DPPH自由基清除率。

（2）对羟基自由基的清除率

①原理：H₂O₂ Fe² =·OH H₂O Fe³

在上述反应体系中，水杨酸会与羟基自由基发生反应，生成2，3-二羟基苯甲酸，该生成物在510nm处，具有特殊的光吸收能力。当在样品中加入猴头菇多糖时，能够清除羟基自由基，从而降低水杨酸的氧化速率，减少中间产物的积累，最后使吸光度值降低。因此，可以用比色法测定其清除能力，吸光度值越小，多糖对羟基自由基的清除作用越强。

②步骤：首先在干净的试管中依次加入1ml 9mmol/l的溶液，2ml的9mmol/l水杨酸-乙醇溶液，再分别在每个试管中加入2ml不同浓度梯度的猴头菇多糖溶液，最后加入2ml的8.8mmol/l的过氧化氢溶液，于常温静置60min，在波长515nm处测其OD值，得A₁值。另取1支干净试管按上述步骤加入试剂，将多糖溶液改为为蒸馏水，作为空白对照，测定其在波长510nm处的吸光度值，得A₀值，并计算清除率。

清除率计算公式：清除率=（A₀-A₁)/ A₀×100%；

用稀释成不同浓度的维生素C溶液替换猴头菇多糖溶液，按上述步骤进行对照实验，并计算对羟基自由基的清除率。

（3）对超氧阴离子自由基的清除率

①原理：邻苯三酚在碱性溶液中能够发生自身氧化作用，这种反应能够产生超氧阴离子自由基，并且伴有显色物质的生成。当将猴头菇多糖溶液加入其中时，能够除去溶液中一部分的超氧阴离子自由基，使邻苯三酚的氧化反应速率下降，最后减少反应过程中显色物质的生成。

②步骤：首先测定邻苯三酚的自氧化速率，再测定加入猴头菇多糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率，最后测定加入不同浓度的维生素C溶液后邻苯三酚的自氧化速率。

超氧阴离子自由基清除活性测定程序

DeterminationofO^2·-.scavengingactivity

试剂	试剂用量(ml)
	空白管	对照管	样品空白管	样品待测管
Tris-HCl缓冲液	4.5	4.5	4.5	4.5
蒸馏水	4.2	4.2	3.2	3.2
待测样品液	—	—	1.0	1.0
（混匀，37℃水浴20min）
去离子水	1.0	—	1.0	—
0.005mol/l邻苯三酚	—	1.0	—	1.0
（混匀后，立即计时并测定）

按的测定程序依次加入各种试剂，混匀后，立即在325nm波长下，每隔30s测定一次吸光度值，至少测定10分钟以上，并记录数据。最后进行数据分析，以A₃₂₅为纵坐标，时间为横坐标绘制曲线，进行计算。

邻苯三酚的自氧化速率为ΔA/Δt；清除率=(F₀-F₁)/F₀×l00%

△A-吸光度变化值；△t-时间的变化值

F₀-对照管中吸光度随时间的变化率

F₁-样品待测管中的吸光度随时间的变化率

(4)绘制图表，进行结果的分析讨论。

4. 参考文献

[1] 张静, 张家臣, 高智席,等. 猴头菇活性成分研究进展[j]. 南方农业, 2016, 10(12): 186-188.

[2] 李岩, 杨凤琼, 崔淑莲. 云芝多糖提取工艺的研究[j]. 海峡药学, 2016, 28(2):45-47.

[3] 陈丽叶, 王令充, 吴皓, 等. 正交试验优化文蛤水溶性多糖的水提醇沉工艺[j]. 中国实验方剂学杂志, 2016, 22(5): 18-21.

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-1学期17~19周和2022-2022-2学期第1周~第2周（2022.12.24~2022.3.10）：查阅资料，准备开题报告，外文论文翻译，猴头菇子实体干燥打粉过筛；

（2）第3周~第4周（2022.3.11~3.24）：预实验，提取猴头菇多糖，练习多糖测定方法；

（3）第5周~第7周（2022.3.25~4.14）：对乙醇体积分数、醇沉时间、醇沉温度、多糖浓度、加醇速度等因素进行单因素实验，选出对醇沉多糖得率影响最主要的因素以及各因素的主要范围；