1. 研究目的与意义
| 随着我国经济的迅速发展，过分地追求工业化进程，以破坏生态环境为代价，人类的生活污水以及各行各业废水的排放量日益增加。水体环境中氮、硫素污染较为严重。普遍认为，氮的污染来源有以下方面:各行业排放未达标的含氮工业废水;城市居民日常生活中产生的生活废水;以及农业中氮肥的使用和畜牧业产生的含氮废水，使得水体的氮含量逐年增加。污水中氮素的存在形式主要为有机氮和包含氨氮(NH4 -N）、硝酸盐氮(NO3--N）、亚硝酸盐氮(NO2--N)等无机氮，长期排放含氮废水将会超出水体的自我恢复能力，造成水体水质恶化，水体富营养化，出现“水华”现象。并且水体处于严重缺氧状态，造成鱼、虾类等水生生物大量死亡。同时如饮用水中氮素含量超标,势必会对人类健康带来危害,例如致癌或患高铁血红蛋白症。 水体的硫素污染主要是硫化物污染，主要来源分为:自然来源。自然的硫化物排放量较少,对人类活动的影响也有限,主要由硫酸盐还原菌以硫酸盐作为电子受体还原为硫化氢的生物过程产生。人为来源。含硫有机废物的厌氧生物处理过程和制革厂过程产生大量的硫化物。以及许多行业废水中存在着大量硫酸盐，硫酸盐经过硫酸盐还原菌(SRB）微生物还原为硫化物，从而引起水体二次污染。硫自养反硝化技术(Sulfur Autotrophic Denitrification,SAD)指某些微生物在缺氧或厌氧条件下利用还原态硫为自养反硝化提供电子的技术,可以同时去除氮硫化合物。在地下水、市政污水、工业废水以及饮用水等含氮﹑硫的污染水体中,通过硫自养反硝化使硫元素和氮元素形态转化发生耦合作用,为污染水体的治理与修复提供参考。 本研究运用纯培养技术分离反应器中活性的硫自养反硝化菌株，并用16S rDNA测序进行，然后研究各菌株的生理生化特性；以期加强对水硫自养反硝化菌群落的系统认识，并建立硫自养反硝化菌种库，可以为进一步推进硫自养反硝化工艺的实际应用奠定坚实的基础。 |
2. 研究内容和预期目标
| 1.以生活污水曝气池的污水为种泥，无氧环境富集培养菌群，分离纯化后得到硫杆菌、硫单胞菌属。 2.对分离纯化后的菌株进行16r DNA提取、PCR测序进行鉴定。 3.取少量菌于液体培养基无氧环境下培养绘制生长曲线，在其对数生长期取一点测定不同温度和PH下的生物量和总氮。 |
3. 研究的方法与步骤
| 1.菌群富集、分离、纯化 1.1以生活污水曝气池的污水为种泥，在密闭发酵罐内通入氮气形成无氧环境富集培养菌群。每24h停止搅拌30min，取上清液1L，加污水1L继续培养。 1.2取发酵罐150mL上清液加入2.25g琼脂制成PH为7.35的培养基。取1mL菌液，将待测样品制成10-1~10-8浓度梯度稀释液。取各个稀释度、同等量的稀释液接种到平板中,使其均匀分布于平板中的培养基内。装入密封袋并打入氮气30℃培养,4d为周期，结合镜检观察，挑选优势菌落。
2.菌株DNA提取及鉴定 取菌液，进行 16S rDNA PCR 基因扩增。 16S rDNA PCR 引物：正向引物ITS1（5’TCCG TAGG TGAA CCTG CGG3'）、反向引物ITS4（5’TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC3'） PCR 扩增体系（20μl）： 10×Ex Taq PCR buffer 2μL dNTP（10mmol/L）1.6μL 正向引物27F1μL 反向引物1492R1μL DNA 模板1μL Ex Taq DNA 聚合酶0.2μL 超纯水13.2μL 扩增程序：95℃（预变性）5min 95℃（变性）30s 62℃（退火）30s 72℃（延伸）5s （循环 30次） 72℃（最终延伸）5min 目的片段长度约为 1.5kb，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，用试剂盒进行胶回收，PCR 扩增产物经纯化后，用 ABI PRISMTM377XL DNA Sequencer 进行测序。 测序引物序列：5′- CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′ 5′-CGGAATTATTGGGCGTA -3′ 5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA -3′ 将测序所得到的序列利用 NCBI 进行相似性搜索。利用MEGA构建进化树
3.菌株的生理生化特性研究 3.1测定生物量和生长曲线：将纯种菌株接种于新制备的液体培养基中，充氮气25min,密封后置于30℃,150r/min的恒温水浴摇床中培养4d，以4d为周期，每0.5d在显微镜下计数，计算生物量，测定其在培养基中的生长曲线。 3.2设定PH范围为5.0~8.0，温度范围25~30℃，取对数生长期时的目的菌在厌氧条件下分批培养 3.2.1测定生物量：每0.5d在显微镜下计数，计算生物量， 3.2.2测定总氮：过硫酸钾氧化，紫外分光光度法。在120-124℃的碱性介质条件下，用过硫酸钾做氧化剂可以将水样中的氨氮、亚硝酸盐氮以及大部分有机氮氧化为硝酸盐。通过测量紫外分光光度计算硝酸盐的含量从而计算总氮的含量。
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4. 参考文献
| [1]车轩,罗国芝,谭洪新,吴嘉敏,蒋燕,齐巨龙,孙大川.脱氮硫杆菌的分离鉴定和反硝化特性研究[J].环境科学,2008(10):2931-2937. [2]范立民,裘丽萍,陈家长,宋超,胡庚东,瞿建宏,孟顺龙,吴伟.养殖池塘系统脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)的分离、生长特性及脱氮特征研究[J].农业环境科学学报,2013,32(01):153-159. [3]郭启臣,边喜龙,王宇清.市政污水人工湿地硫自养反硝化性能研究[J].水处理技术,2020,46(09):104-107. [4]牛建敏,李睿华.理化因素对脱氮硫杆菌自养反硝化的影响[J].中国环境科学,2010,30(01):76-81. [5]马潇然,郑照明,卞伟,李军,周荣煊,杨京月.硫自养反硝化系统运行效能和微生物群落结构研究[J].中国环境科学,2020,40(10):4335-4341. [6]方文烨,李祥,黄勇,郭超然,胡羽婷,陶仁杰.单质硫自养短程反硝化耦合厌氧氨氧化强化脱氮[J].环境科学,2020,41(08):3699-3706. [7]刘波文,刘济忠,石井裕之.QCL-SODP硫自养脱氮技术在废水脱氮中的应用[J].环境生态学,2020,2(01):85-88. [8]佘栋宇,谢秀祯,王锐萍,张鉥孟,黎佳媛,黄循吟.脱氮硫杆菌对硫酸盐还原菌生长的抑制作用[J].基因组学与应用生物学,2013,32(01):65-69. [9]李芳芳,施春红,李海波.邻苯二甲酸氢钾对硫自养反硝化工艺的影响研究[J].环境科学与管理,2020,45(01):79-83. [10]王翔,陈涛,孔德芳,朱召军,李鸿.温度对硫自养水平潜流人工湿地脱氮效果的影响[J].中国给水排水,2020,36(23):75-80. [11]杨军,张翰澍,李彭,张波.无机硫源自养反硝化电子供体选择及研究现状[J/OL].工业水处理:1-13[2021-03-03]. [12]张鉥孟,刘燕,佘栋宇,王锐萍,黄循吟,谢秀祯.一株脱氮硫杆菌的筛选及其脱氮除硫性能分析[J].基因组学与应用生物学,2013,32(04):449-452. [13]周娅,买文宁,代吉华,孙培彬,曾令斌,唐启.硫代硫酸钠联合硫铁矿自养反硝化脱氮性能[J].中国环境科学,2020,40(05):2081-2086. [14]周圆,李怀波,郑凯凯,吕金泽,李激.新型组合工艺处理印染废水中试效能及微生物菌群分析[J].环境工程学报,2020,14(11):3030-3041. [15]胡智丰,邓时海,张超,李德生,彭帅.集成式铁基质生物膜反应器自养反硝化深度脱氮[J].化工学报,2020,71(07):3304-3312. [16] Han F , Zhang M , Shang H , et al. Microbial community succession, species interactions and metabolic pathways of sulfur-based autotrophic denitrification system in organic-limited nitrate wastewater[J]. Bioresource Technology, 2020, 315:123826. [17] Hang Q , Wang H , He Z , et al. Hydrilla verticillata–Sulfur-Based Heterotrophic and Autotrophic Denitrification Process for Nitrate-Rich Agricultural Runoff Treatment[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2020, 17(5):1574. [18] Bi Z , Zhang W , Ni M , et al. Fe0/Fe2 -Dependent Nitrate Reduction in Anammox Consortia Questions the Enzymatic Mechanism of Nitrate Reduction by Anammox Bacteria[J]. ACS Sustainable Chemistry Engineering, 2020, 8(40):15278-15287. [19] Fu C , Li J , Lv X , et al. Operation performance and microbial community of sulfur-based autotrophic denitrification sludge with different sulfur sources[J]. 2020. [20] Qiu Y Y , Zhang L , Mu X , et al. Overlooked pathways of denitrification in a sulfur-based denitrification system with organic supplementation[J]. Water Research, 2020, 169(Feb.1):115084.1-115084.11.
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5. 计划与进度安排
| 1、2022-3-1～2022-3-14接受任务、查阅和翻译文献，撰写开题报告； 2、2022-3-15～2022-3-28完成实验前准备工作，配制各实验所需药品； 3、2022-3-29～2022-4-11菌群富集、分离、纯化； 4、2022-4-12～2022-5-9菌株DNA提取及鉴定； 5、2022-5-10～2022-5-23菌株的生理生化特性研究； 6、2022-5-24～2022-6-9完成论文撰写工作与答辩。
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