1. 研究目的与意义
研究背景：
烷基酚（alkylphenols，aps）是一类由酚烷基化后产生的化合物。作为表面活性剂，具有良好的润湿、渗透、乳化、分散、增溶和洗涤作用，是一类重要的精细化工原料，在纺织印染、农药乳化剂等相关工业中有着广泛应用。同时，烷基酚作为一种仿雌激素，也是已知的内分泌干扰素。具有激素效应，会破坏机体内环境的平衡，导致生殖障碍、生长发育异常和代谢紊乱等一系列问题，是内分泌干扰物中危害较大的一类。因此，针对aps的检测技术和方法的研究具有重要意义。
目前，分离检测aps常采用的方法有固相萃取（spe）、基质分散固相萃取、酶抑制法、高效液相色谱（hplc）、气质联用（gc-ms）等方法。spe具有操作简单快速、回收率高、适用范围广等优点，是目前样品前处理中的主流净化技术，因此spe也是目前分离、富集食品中ap、apeo最常用的方法；基质分散固相萃取是类似于spe的一种提取、净化、富集技术，可直接处理固体、半固体和粘性液体样品，浓缩了传统的样品前处理中的样品匀化、提取、净化等过程，不需要进行组织匀浆、沉淀、离心和样品转移等操作步骤，避免了样品的损失；高效液相色谱适用于分析难挥发的大分子有机化合物。对于ap（eo）n（n＞3），因其挥发性较低，比较适合用hplc分析，但是受检测器的限制，该法选择性和定性能力较差；gc-ms结合了气相色谱和质谱的两者之长，具有定性能力强、灵敏度高、选择性好的优点，广泛用于易挥发有机污染物的分析。ap及短链apeo具有极性，不易挥发，不适合gc-ms分析，但将其衍生化后，其衍生物可适用于gc-ms分析，gc-ms对于ap及短链apeo具有较好的灵敏度和线性范围，但大多需要衍生化处理后才能进样，操作繁琐，而且gc-ms对于不易挥发的长链apeo无能为力。由于现有的烷基酚检测方法都存在一些缺陷，所以建立更加经济简便高效的烷基酚检测方法具有重要的实际意义。
2. 研究内容和预期目标
本论文拟采用氧化石墨烯辅助分离的selex技术（go-selex），筛选烷基酚的ssdna适配体。
研究内容包括：
（1）制备go悬浮液，测定go吸附ssdna的质量比。
3. 研究的方法与步骤
一、实验研究方法
1、制备GO悬浮液，测定GO吸附ssDNA的质量比；
2、采用GO辅助分离的SELEX技术刷选靶标烷基酚的ssDNA适配体，通过增强筛选压力，提高筛选得到的适配体的亲和力；通过反筛，提高筛选得到的适配体的特异性；
3、对筛选得到的ssDNA富集库进行测序，并对序列进行软件分析，确定适配体候选序列。
二、实验步骤
1、准备实验药品和器具，未使用过的仪器学会正确操作使用；
2、配制溶液
①10×TBE（pH7.4）：取54 g Tris碱，27.5 g硼酸，20 mL（0.5 mol/L）EDTA（pH 8.0）溶于蒸馏水中，并定容至500 mL。
②1×TBE：取100毫升10×TBE，加水补足至1 L。
③Bindingbuffer：50 mM Tris（3.02825 g）、150 mM NaCl（4.383g）、2 mM MgCl2 （0.2033 g）充分溶解后加蒸馏水定容至500 mL。
5×Binding buffer（pH 7.5）：用分析天平称取三羟甲基氨基甲烷1.514 g、氯化钠2.922 g、氯化钾0.932 g、氯化镁0.254 g，加入蒸馏水溶解，加入二甲基亚砜25 mL，置于100 mL容量瓶中定容，调pH至7.5，高压蒸汽灭菌Binding Buffer溶液，待冷却后装入试剂瓶置于4℃冰箱中保存待用。
④氯仿-异戊醇溶液：取氯仿溶液与异戊醇溶液按24：1的比例混合。
⑤酚-氯仿-异戊醇溶液：取酚溶液、氯仿溶液和异戊醇溶液按25：24：1的比例混合。
⑥醋酸钠溶液：取醋酸钠晶体20.415 g溶于蒸馏水中并定容至50 mL。
⑦10%过硫酸铵：称取1 g过硫酸铵，加入10 mL蒸馏水后搅拌溶解，分装到1 mL的EP管内，保存于-20℃冰箱。
⑧15 mg/mL氧化石墨烯溶液：称取氧化石墨烯450 mg，加30 mL蒸馏水，在冰浴条件下用超声波细胞粉碎机粉碎2小时，置于4℃冰箱中保存待用。
⑨70%乙醇300 mL：量取无水乙醇210 mL、加入蒸馏水90 mL。
⑩2.48 nmol/μL辛基酚500 μL：称取256.3mg辛基酚，量取500 μL甲醇溶解，分装成5份，置于 冰箱保存。3、对实验过程中要使用的枪头、玻璃仪器和相关溶液等进行灭菌；
4、首先，优化GO/ssDNA质量比。取等量ssDNA文库加入分别加入不同量的15 mg/mL GO悬浮液，使GO/ssDNA质量比分别为500、400、300、200、100、0，再用结合缓冲液（Binding buffer，BB）（50 mM Tris，150 mM NaCl，2 mMMgCl2，pH 7.4）补足反应体积至200 μL。混匀后，37°C 避光振荡孵育1 h，然后12000 r/min离心15 min，取上清液以其为模板进行扩增，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确定最符合要求的质量比。
5、确定好质量比后进行GO-SELEX筛选。GO-SELEX筛选分为三轮，分别是正筛、次级正筛以及反筛。首先将ssDNA文库与靶标辛基酚结合，于37°C孵育一定时间；然后加入GO悬浮液，混匀后继续在37°C条件下振荡孵育，吸附未与靶标结合的游离ssDNA；将混合物12000 r/min离心15 min，吸取上清液，弃去沉淀（包含GO及被其吸附的ssDNA）；再以上清液为模板（包含与靶标辛基酚结合的ssDNA）进行PCR扩增；纯化PCR产物后，用Lambda核酸外切酶酶切制备ssDNA；最后，纯化ssDNA并测定核酸浓度，作为下一轮筛选的次级文库。
6、其次，将筛选出的ssDNA文库与GO悬浮液混合振荡孵育；离心弃上清，留沉淀，用结合缓冲液反复洗涤沉淀数次；然后用结合缓冲液重悬沉淀，加入靶标辛基酚，混合孵育，诱导有亲和力的ssDNA从GO表面解吸附进入上清与辛基酚结合；再次离心，取包含辛基酚-ssDNA复合物的上清液进行PCR扩增；随后和第一轮一样，纯化PCR产物，Lambda核酸外切酶酶切制备ssDNA，纯化ssDNA作为下一轮筛选的次级文库。
7、最后进行反筛，选择两种辛基酚的结构类似物进行反筛，以消除可能与这些反筛靶标结合的非特异性ssDNA。首先，将反筛靶标与ssDNA文库混合，于37°C孵育；然后加入GO悬浮液混合，继续振荡孵育；离心，弃去包含反筛靶标-ssDNA复合物的上清液，用结合缓冲液洗涤沉淀数次；随后用结合缓冲液重悬沉淀，并加入靶标辛基酚，诱导有亲和力的ssDNA从GO表面解吸附后与其结合；再次离心取上清液之后，依次进行PCR扩增，纯化 PCR 产物，酶切制备单链，纯化酶切产物的操作，得到次级文库用于下一轮筛选。
8、PCR扩增的条件为：94 °C预变性5 min；94°C变性30 s，53 °C退火30 s，72°C延伸30 s，循环20次；72 °C延伸5 min。在此过程中要先确定适合的延伸温度以及扩增轮数以得到最多的ssDNA。用于扩增的PCR体系共50 μL：10×PCR Buffer 5 μL，primer50.5 μL，primer6 0.5 μL，dNTP 0.5μL，模板 1 μL，Taq酶 0.5 μL，水 42 μL 。9、用Lambda核酸外切酶处理PCR产物，酶切去除5’末端磷酸化的反义链，制备ssDNA。含7 M尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确认酶切是否完全。PCR产物和酶切产物都用酚氯仿抽提法进行纯化，再通过乙醇沉淀法回收，最后测定核酸浓度；
纯化DNA的步骤为取一定体积的DNA（PCR产物，酶切后的ssDNA相等），加入等体积的酚：氯仿：异戊醇溶液，旋转混匀30 s，4 ℃ 2000 rpm离心5 min，再4℃ 8000 rpm离心1 min，将上清液小心取出移入另一离心管中；随后在上清中加入等体积氯仿：异戊醇混匀，离心收集上清并转移；在上清中加入1/10体积的3 M NaAC充分混匀再加入两倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20 ℃沉淀过夜，4 ℃ 13000 rpm离心15 min，去上清，加入200 μL70%乙醇，上下颠倒洗涤沉淀，再在4 ℃ 13000 rpm离心5 min，去上清，可见白色固体沉淀，室温放置使残留乙醇挥发（也可在50-60℃烘箱烘干），然后用一定体积的超纯水或TE溶解。
10、重复以上步骤多次并适当改变反应条件，直至筛选出合适的适配体。
为提高核酸适配体的亲和力，需要不断提高筛选压力，逐渐减少靶标和文库用量，减少孵育时间，具体参数见表1。
表1 每一轮SELEX的筛选条件
| 轮数 | ssDNA 文库（pmol） | ssDNA文库与 靶标OA的孵育时间（h） | ssDNA文库与 GO的孵育时间（h） | 反筛靶标 |
| 1 | 2000 | 3 | 1 | — |
| 2 | 200 | 3 | 1 | — |
| 3 | 200 | 3 | 1 | — |
| 4 | 200 | 2.5 | 1 | — |
| 5 | 200 | 2.5 | 1 | — |
| 6 | 200 | 2 | 1.5 | 壬基酚 |
| 7 | 200 | 2 | 1.5 | — |
| 8 | 200 | 2 | 1.5 | 双酚A |
| 9 | 200 | 1.5 | 1.5 | — |
| 10 | 100 | 1.5 | 1.5 | 壬基酚 |
| 11 | 100 | 1.5 | 2 | — |
| 12 | 100 | 1 | 2 | 双酚A |
| 13 | 100 | 1 | 2 | — |
4. 参考文献
[1] 季晓亚, 李娜, 袁圣武, 等. 环境雌激素生物效应的作用机制研究进展[j]. 生态毒理学报, 2017, 12（1）: 38-51.
[2] 李亚楠, 赵洁, 张傲哲, 等. 核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展[j]. 生物技术通报, 2017, 33（4）: 78-82.
[3] 张桂兰, 朱超, 黄亚飞, 等. 基于适配体技术的雌性激素检测方法研究进展[j]. 分析测试学报, 2017, 36（3）: 422-430.
5. 计划与进度安排
（1）2022-2022-1学期17~19周和2022-2022-2学期第1周~第4周（2022.12.28~2022.3.28）：查阅资料, 准备开题报告, 外文论文翻译；
（2）第5周~第6周（2022.3.29~4.11）：预实验, 配制相关试剂, 练习各个筛选步骤的操作方法, 测定go吸附ssdna的质量比；
（3）第7周~第11周（2022.4.12~5.16）：采用go辅助分离的selex技术刷选靶标烷基酚的ssdna适配体, 逐轮增强筛选压力, 采用反筛靶标进行反筛；
