氧化石墨烯辅助分离的核酸适配体筛选方法的研究开题报告

1. 研究目的与意义

研究背景：

一、核酸适配体的概念

2. 研究内容和预期目标

本论文拟改进go辅助分离的selex技术，对孵育结合、pcr扩增、制备单链的条件进行优化，并对筛选得到的ssdna库进行测序分析。

3. 研究的方法与步骤

一、实验研究方法

1、制备GO悬浮液，优化GO/ssDNA质量比；

2、利用GO进行孵育结合，然后进行离心分离、PCR扩增、核酸外切酶消化制备ssDNA、DNA纯化等步骤，对孵育结合、PCR扩增、核酸外切酶消化的条件进行优化；

3、对筛选得到的ssDNA富集库进行测序，并对序列进行软件分析，确定适配体候选序列；

二、实验步骤

1、准备实验药品和器具，未使用过的仪器学会正确操作使用；

2、对要使用的玻璃仪器、移液枪枪头等进行灭菌；

3、配置溶液：

（1）1×TE溶液（pH7.4）：使用分析天平称取三羟甲基氨基甲烷0.606 g、乙二胺四乙酸二钠0.186 g，加入蒸馏水溶解，置于500 mL容量瓶中定容，用稀盐酸调pH至7.4，高压蒸汽灭菌，待冷却后装入试剂瓶置于4℃冰箱中保存待用。

（2） 5×Binding Buffer（pH 7.5）∶使用分析天平称取三羟甲基氨基甲烷3.028 g、氯化钠4.383g、氯化镁0.203g，加入蒸馏水溶解，置于500 mL容量瓶中定容，调pH至7.5，高压蒸汽灭菌，待冷却后装入试剂瓶置于4℃冰箱中保存待用。

（3） 10×TBE溶液：称取三羟甲基氨基甲烷54.0 g，硼酸27.5 g，乙二胺四乙酸二钠3.722 g，在500 mL容量瓶中加入蒸馏水定容。

（4） 1×TBE溶液∶量取10×TBE溶液100 mL、加入蒸馏水900 mL，混匀置于常温备用。

（5） 氯化钠溶液（0.1mol/L）∶使用分析天平称取5.844g氯化钠固体溶于部分蒸馏水中，定容至1000 mL即可得0.1mol/L氯化钠溶液共1L。

（6） 氯化钾溶液（3 mol/L）：使用分析天平称取2.235 g氯化钾固体，同时用量筒量取10 mL蒸馏水将其溶解。

（7） 15 mg/mL氧化石墨烯溶液：称450 mg氧化石墨烯，加10 mL50%乙醇，在冰浴条件下用超声波细胞粉碎机粉碎2小时，置于4℃冰箱中保存待用。

（8） 2.48 nmol/μL辛基酚：称取256.3 mg辛基酚，量取500 μL乙醇溶解，分装成5份，置于-20℃冰箱中保存。

（9） 2.27 nmol/μL壬基酚：取500mg壬基酚，量取1000μL乙醇溶解，分装成5份，置于-20℃冰箱中保存。

（10） 1.75nmol/μL双酚A：称取200mg双酚A，量取500 μL乙醇溶解，分装成5份，置于-20℃冰箱中保存。

（11） 醋酸钠溶液（0.4083 g/mL）：用分析天平精确称取20.415 g醋酸钠，并用量筒量取50 mL蒸馏水将其溶解，至于4℃冰箱中备用。

（12） 氯仿-异戊醇溶液∶量取氯仿48mL、异戊醇2mL，混合，置于4℃冰箱中保存。

（13）酚-氯仿-异戊醇溶液∶量取酚25 mL、氯仿24 mL、酚1mL，混合，置于4℃冰箱中保存。

（14） 上样缓冲液：用分析天平称取溴酚蓝0.025 g，蔗糖4 g，量取蒸馏水10 mL，用超声波清洗剂助溶，溶后置于4℃冰箱中保存。

4.具体实验步骤

① 确定GO与ssDNA的质量比：由于不同长度的ssDNA在GO表面表现出来不同的结合动力学，所以在进行GO-SELEX之前，为了保证GO能够完全吸附未结合的游离的ssDNA，有必要对GO/ssDNA的质量比进行不断优化，以获得最优的GO/ssDNA质量比。本实验使GO/ssDNA质量比分别为500、400、300、200、100、90、80、70、0，再用Binding buffer补足反应体积至200μL。混匀后，37℃避光振荡孵育1h，然后12000r/min离心15min，取上清液，分别测定其核酸浓度，以确定其最适质量比。

② 孵育：首先，将ssDNA文库与靶标混合，于37°C孵育一定时间，使它们充分混合，然后加入GO悬浮液，混匀后继续在37°C条件下振荡孵育一段时间，以吸附未与靶标结合的游离ssDNA。此过程需优化孵育时间，其中孵育时间包括ssDNA与靶标的孵育时间及加入GO后GO与游离ssDNA结合时间。

③ 分离：将混合物置于离心机内12000r/min离心15min，吸取上清液（上清液中包含靶标与ssDNA的结合体），弃去沉淀（包含GO及被其吸附的ssDNA）。

④　PCR扩增：以上清液为模板（包含与靶标结合的ssDNA）进行PCR扩增，PCR扩增反应的条件为：

95 °C 预变性 5 min

95 °C 变性 30 s

60 °C 退火 30 s 共20轮

72 °C 延伸 30 s

72 °C 再延伸 5 min

PCR 反应体系为：

模板（上清液） 1 μL

dNTP 混合液（各5 mM） 1 μL

正向引物（10 μM） 1 μL

磷酸化反向引物（10 μM） 1 μL

Taq plus DNA聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL

10×PCR缓冲液（含Mg² ） 5 μL

灭菌超纯水 39.5 μL

总体积 50 μL

此过程需优化引物、dNTP、文库模板的加入量以及退火温度、扩增反应轮数。得到的PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测。

① 纯化dsDNA：扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化，并NanoDrop-2000微量紫外分光光度计测定其核酸浓度。

② 制备ssDNA：通过Lambda核酸外切酶酶切去除PCR产物中的5’磷酸化标记反义链得到ssDNA。酶切反应体系为400μL，包括纯化的PCR产物358μL、10×Lambda核酸外切酶缓冲液40μL和Lambda核酸外切酶（5000 U/mL）2μL。反应条件为：37°C水浴1 h进行酶切，75°C水浴10 min终止反应。此过程需要优化核酸外切酶浓度、反应温度及反应时间。用含7 M尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证酶切是否完全。

③ 纯化ssDNA：取一定体积的ssDNA，加入等体积的氯酚:氯仿:异戊醇（V:V:V=25:24:1)，旋转混匀30s，4℃2000rpm离心5min，再4℃8000rpm离心1min，将上清液取出移入另一离心管中。在上清中加入等体积氯仿:异戊醇（V:V=24:1)，混匀，离心收集上清到转移到另一离心管中。在上清中加入1/10体积3M NaAc，充分混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀后置于-20℃沉淀过夜。4℃13000rpm离心15min，去上清，加入200μL70%乙醇，上下颠倒洗涤沉淀，再在4℃13000rpm离心5min，去上清，可见白色固体沉淀，室温放置使残留乙醇挥发，然后用一定体积的超纯水或TE溶解。

④ 为提高核酸适配体的亲和力，需要不断提高筛选压力，进行多轮筛选。

表1每一轮SELEX的筛选条件

4. 参考文献

[1]孙婉玲，王立博.核酸适配体技术在食用农产品中汞检测的应用与展望[j].食品安全导刊，2021(03):157-159 161.

[2]潘成，朱芯蔚，杨妍，等.基于核酸适配体快速可视化检测大田软海绵酸[j/ol].分析试室:1-8.

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-1学期17~19周和2022-2022-2学期第1周~第4周（2022.12.28~2022.3.28）：查阅资料，准备开题报告，外文论文翻译；

（2）第5周~第6周（2022.3.29~4.11）：预实验，配制相关试剂，练习各个筛选步骤的操作方法，测定go吸附ssdna的质量比；