1. 研究目的与意义
鲀形目(tetraodontiformes)现存10科100属约350种，主要分布在热带和亚热带海洋，仅少数种类定居在淡水中，或在一定季节进入江河。鲀形目很多种类是重要的养殖鱼类和海洋捕捞对象，东方鲀属(takifugu)鱼类近年来在水产养殖、河豚毒素医药开发、脊椎动物基因组研究方面有着广泛的应用，具有重要的经济地位、科研及医药价值，与此同时误食河鲀引起的中毒乃至死亡事件也时有发生。准确的物种鉴定不仅能有效地区分鲀毒鱼类，而且可以促进渔业资源合理开发、生态调查及生物多样性保护。但由于鲀形目鱼类外部形态总体差异较大，近缘种间十分相似，传统分类学多以条纹、斑点、体色等易受主观因素影响的形态特征作为主要辨别依据，以致至今鲀形目鱼类分类一直存在着不少争议。
线粒体是真核细胞内重要的细胞器，多年来的研究发现线粒体有其自己的一套遗传控制系统，同时也受到细胞染色体dna的控制。近年来，动物线粒体dna(mtdna)的进化遗传学方面的研究越来越普遍。mtdna是一种位于核外的胞质遗传系统，几乎仅遵从母系遗传，一般不发生重组，父本线粒体在受精过程中被迅速降解。mtdna能以自身为模板进行复制，能转录生成信使rna(mrna)、转运rna(trna)和核糖体rna(rrna)，也能编码合成一些维持自身结构和功能所必需的蛋白质，具有很大的独立性。动物线粒体基因组是共价闭合的环状双链dna，分子量较小，一般在15.7-19.5kb，处于限制性内切酶的分析范围，基因组的结构比较简单、稳定，便于进行结果分析。鱼类mtdna同样也具有这些优点，这使得其在鱼类类群识别，物种的起源、分化和扩散及分子生物地理学方面发挥了巨大的作用。
近些年来，利用线粒体部分或全序列数据对于鱼类的分类和系统关系研究也有了初步的成果。2003年miya等研究了100种鱼类线粒体全序列进化关系。2007年yamanoue等基于多种硬骨鱼类mtdna基因组的蛋白编码、trna和 rrna等基因分析了鲀形目在鲈形总目中的进化地位。2009年yamanoue等基于mtdna全序列探讨了东方鲀属类群在生物进化中地位及研究的意义。张玉波等人对东方鲀属11种鱼类的线粒体内cyt-b基因、12srrna基因序列分析和d-loop基因序列分别采用邻接法(nj)、最大简约法(mp)、最大似然法(ml)和贝叶斯方法构建了分子系统树，证明了东方鲀属鱼类为一单系类群。2012年程长洪等利用相关序列扩增多态性(srap)标记分析暗纹东方鲀群体遗传多样性，指出所研究的4个群体具有较高的遗传多样性，群体间存在一定的基因流。2014年李玉芳对南海海域5个黄鳍马面鲀群体线粒体dna cyt-b基因156个个体和d-loop区基因158个个体进行遗传多样性分析，发现群体间无显著遗传分化，5个群体基因交流充分，存在遗传同质性。
2. 研究内容和预期目标
内容
(1) 线粒体基因组dna的提取和纯化
使用苯酚-氯仿法提取纯化暗纹东方鲀肌肉组织的基因组dna，用琼脂糖凝胶电泳检测。
3. 研究的方法与步骤
预实验
从12s rrna、16s rrna和coii基因中确定一个分类准确率最高的基因并设计一对特异性引物，确定pcr的退火温度、延伸时间和循环次数，确认lb培养基的配方，对整个流程进行检查。
正式实验
1、苯酚-氯仿法提取dna
4. 参考文献
[1]张玉波,甘小妮,何舜平.线粒体d-loop序列变异与东方鲀属鱼类系统发育[j].水生生物学报,2009,33(04):656-663.
[2]程长洪,张敏莹,刘凯,等.利用srap标记研究四个暗纹东方鲀群体的遗传多样性[j]. 水生生物学报,2012,36(05):858-865.
[3]李玉芳.南海黄鳍马面鲀种群分析[d].上海海洋大学,2014.
5. 计划与进度安排
（1）2022-2022-1学期17-20周---2022-2022-2学期第1周：接受任务书。查阅资料，确定所选基因，准备开题报告，外文论文翻译。
（2）第2周---第5周：综合相关文献资料，撰写开题报告，完成实验前准备工作，掌握配制各实验所需药品；学习提取鱼的基因组dna和扩增线粒体相关基因的方法。从备选基因确定一个作为目的基因，学会使用pcr仪，对pcr反应体系，循环参数进行摸索和调整等措施，学会制胶，学习制备感受态细胞，pcr目的基因。
（3）第6周---第11周：掌握pcr扩增产物的鉴定与割胶回收，回收纯化产物与载体连接，转化到感受态细胞中，利用白斑筛选阳性克隆，用质粒dna小量试剂盒提取质粒，用双酶切鉴定阳性菌落，阳性菌落质粒dna送到生物公司进行测序。
