松针多酚酶解提取工艺及生物活性研究开题报告

1.1 研究背景

1.1.1松科植物的研究现状

（1）松科植物的发现与发展

我国松科药物活性的利用具有悠久历史，据《本草纲目》记载：“松叶，名为松毛，性温苦，无毒，入肝、肾、肺、脾诸经，治各脏肿毒，风寒湿症．还能治疗肿疱，促进毛发再生，强健肝、肾、心、脾、肺五脏，能够充饥，延年益寿”^[1]。马尾松、雪松、红松、黑松、马尾松等都是可药用的松科植物。松科植物的不同部位如树皮、松果、树脂、松针等可用于风湿、抗炎、抗氧化等方面，而松针是松科植物的主要药用部位，松针的提取物具有较强的药用价值，有镇痛消炎、止咳祛痰、抗氧化、抗衰老、抗突变、降血脂、降血糖、抑菌等功效。

（2） 松针主要活性成分

①多酚类化合物：植物多酚类化合物又称植物单宁，是一类拥有一个或多个芳香环并含有一个或几个羟基基团的混合物，一般分为黄酮类化合物、木脂素类化合物、儿茶素和原花青素类化合物等^[2]。多酚是天然抗氧化剂成分之一，可以清除自由基物种或抑制活性物种的生成过程中正常的细胞代谢,从而防止损伤脂质,蛋白质,核酸和最终的细胞损伤和死亡^[3]。对此，也进行了大量研究,结果发现，机体中的氧化反应和自由基导致了细胞损伤、炎症、肿瘤和心血管疾病的发生，植物多酚类物质能够将氧化进程抑制或者中断，并且平衡机体自由基的数量^[4]，可预防氧化应激所引发的如动脉粥样硬化、心脑血管疾病、老年痴呆症、帕金森氏病、肿瘤等疾病 ^[5]。松科植物体内就含有大量多酚物质，其独特的化学性质和生物活性，使其具有抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、消炎以及抑菌等生理功能。

②黄酮类化合物：黄酮类化合物是一种广泛存在于松针内的多酚类物质，在植物体内以游离态或者糖苷存在，有活泼的羟基氢，因而具有抗氧化性、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降血脂等功能特性。黄酮类物质有较强的抗氧化活性^[1]。黄酮类化合物的提取方法也有多种，如溶剂提取法、超声波辅助提取法、酶解法等。

③挥发性油：松针挥发油又称精油，是松针化学成分中的挥发性成分，也是研究较多的成分之一。松针挥发油成分复杂，含有数十种化学成分，常用的提取方法包括水蒸气蒸馏法、超临界CO₂萃取法、溶剂萃取法等。松针挥发油具有消炎、抗菌、抗病毒、降血脂、降血糖、 软化血管、强化器官等功效。可祛风活血、明目安神、 解毒止痒、除口臭、去口干舌燥、治便秘 ^[1]。

④莽草酸：松针内含有丰富的莽草酸，是植物代谢过程的中间产物，具有抗炎、止痛作用，是抗病毒和治疗癌症药物的中间体^[6]，莽草酸还具有防止血栓生成的作用。

1.1.2 响应面法优化提取工艺

响应面分析法，即响应曲面设计方法，是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。响应面方法是结合统计学和数学软件模拟、分析实验问题建立经验模型，在实验条件选择过程中，可以连续的对实验的各个水平进行分析，并能在保证所有因素都分析到的情况下减少试验次数，并得到拟合方程和最优工艺条件组合^[7]。本实验采用响应面中心组合设计，应用Design-Expert 8.0.6响应面软件的方法对松针多酚物质的提取工艺条件进行优化，得出松针多酚物质最优提取工艺条件。

1.2研究进展

1.2.1 马尾松的植物学特征

松针为松针 (Pine needle)系松科 ( Pinaceae)松属（Pinus) 植物的叶, 别名猪鬃松叶、松毛, 我国松科松属植物有22种10变种, 资源极其丰富, 分布遍及全国各地, 可药用的有13个种, 南方有马尾松、湿地松、油松、华山松、云南松等, 北方有红松、黑松、雪松^[8]。本次实验主要采用马尾松的松针为原料。马尾松（Pinus massoniana L.）为松科（Pinaceae），松属（Pinus)乔木，为喜光、深根性树种。松针是马尾松的主要副产物，也是具有药理作用的代表部位，其富含黄铜类、木脂类、维生素类、多糖类和微量元素等天然抗氧化活性物质，且无毒，无副作用，可作为天然抗氧化剂^[9]。

图2 马尾松植株图（摘自中国植物志）

1.2.2 松科植物地理分布

本科约230余种，分属于3亚科10属，多产于北半球。我国有10属113种29 变种（其中引种栽培24种2变种），分布遍于全国，几乎均系高大乔木，绝大多数都是森林树种及用材树种，在东北、华北、西北、西南及华南地区高山地带组成广大森林，亦为森林更新、造林的重要树种。有些种类可供采脂、提炼松节油等多种化工原料，有些种类的种子可食或供药用，有些种类可作园林绿化树种 ^[10]。而马尾松为长江流域以南重要的荒山造林树种。

1.2.3 马尾松的生态及经济价值

马尾松具有极高的药用价值，树干可割取松脂，为医药、化工原料。其树干与根部树脂含量丰富，是重要的医药化工原料，可用于合成香料、生产杀虫剂以及制肥皂和润滑油等．树干还可以作为茯苓等名贵菌蕈类的培养基质，树皮用于提取栲胶．其叶根均可入药，性温，无毒，祛风行气、活血止痛，舒筋、止血等^[11]。同时可供建筑、枕木、矿柱、家具及木纤维工业（人造丝浆及造纸）原料等用。马尾松能生于干旱、瘠薄的红壤、石砾土及沙质土，或生于岩石缝中，为荒山恢复森林的先锋树种，具有良好的适应性和抗逆力，是一种优秀的经济树种，松脂和木材的收益率高，材质好，同时各部位含有多种活性成分，不仅使良好的绿植和建筑材料，更能作为药用植物发挥重要作用。

1.2.4 松科植物多酚的主要研究现状

(1) 松多酚提取工艺：多酚类化合物的传统提取方法是溶剂浸提法，但该方法存在提取时间长、提取率低等缺点。酶解法虽条件温和、提取时间短，但是成本较高。超声波辅助提取法是近年来发展起来的新型提取分离技术，具有提取速度快、得率高及对热敏感、热不稳定物质破坏少等优点。如Herrera等发现超声辐射对草莓中多酚化合物的提取率有明显的提高; 郭英等研究表明，利用超声波辐射作用可使广枣中多酚的提取时间明显缩短; Hromádková等从麦麸中提取多酚类化合物时，发现当收率相同时，超声作用可使提取时间由传统的60min缩短为5min ^[12]。最新的提取方法采用的是超临界CO₂萃取法，该方法工艺简单，提取率高，生产周期短，但对设备要求较高。本次实验中采用超声波辅助酶解法来提取马尾松松针的多酚物质，并探究不同的条件下对其提取率是否有所影响，从而得到最佳提取条件。

（2）功能研究进展：

（一）抗氧化及抗衰老作用：清除自由基的能力:从法国海岸松和澳洲放射松树皮中提取多酚类物质，测定两种松树皮多酚对自由基的清除能力。两种松多酚提取物中均有pFA和rFA两种花青素，含量高达65~87%。

抗氧化剂的协同作用: M Sivoňová等，研究法国沿海松树树皮具有丰富多酚类提取物具有强大的抗氧化潜力和促进细胞健康的作用，研究多酚提取物与人工合成的抗氧化剂抗坏血酸和生育酚协同可以显著增加抑制脂质过氧化作用。提取物和生育酚同时添加到氧化脂质体起到附加的预防效果。

保护生物大分子和体内外氧化损伤:由氧化引起的受损蛋白质的积累是衰老的一个重要的标志和引起神经退行性疾病，包括老年痴呆症，帕金森病等疾病^[13]。Taner G研究表明松树皮提取物能保护淋巴细胞免受过氧化氢诱导的基因损伤。胡丰林和王焰山等对松针的提取液进行分析，结果表明松针提取液含有β-胡萝卜素、维生素C和维生素E等，具有改善人体机能和抗老化等功能^[14]。

抑制脂质过氧化:苏晓雨对红松松壳多酚提取物的研究结果显示，红松松壳多酚能有效地抑制肝匀浆及卵黄脂质过氧化，体内实验表明红松松壳多酚可以有效抑制小鼠的亚急性衰老反应，松壳提取物具有抗衰老作用和较强抗氧化活性，可以有效清除羟自由基、DPPH自由基及超氧阴离子，其中清除羟自由基作用最为明显，是一种具有开发潜力的天然抗氧化剂。Shiori Nakayama等研究松树皮提取物对低密度脂蛋白和单核细胞的抗氧化功能，松树皮提取物可以加强抗氧化酶的表达，使谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、血红素氧合酶的含量提高。松树皮提取物可以显著延长低密度脂蛋白氧化的滞后时间，提高单核细胞的抗氧化防御能力^[13]。

（二）镇痛消炎功能：松针提取物中的活性成分具有镇痛消炎作用。毕跃峰等在研究中发现，马尾松的提取物正丁醇(主要为莽草酸) 具有镇痛作用。非甾体类药物常用止痛药服用，但是这类药具有毒副作用，J C Maroon等人用松树皮提取物的抗炎功能作为缓解疼痛的替代物具有较好的效果。帕金森病发病机理与氧化应激和炎症有着密不可分的联系。M M Khan等研究使用1-甲基-1-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP药物)注射全身的小鼠模型，海岸松提取物对诱发性神经炎症、神经退化和行为障碍有明显治疗作用，因此PYC-诱导适应氧化应激和炎症的神经退行性疾病，包括帕金森症可以用全新的途径进行临床干预^[13]。

（三）抗菌抗病毒：松针提取物中的黄酮类物质以及松针油中的某些成分都具有较强的抑菌活性。徐丽珊等分别观察马尾松、马尾松和黑松的水提物与醇提取物对枯草杆菌、曲霉的抑制效果，最终得到松针提取物均有抑菌效果，醇提取液的抗菌效果更为广泛^[15]。李丹苏研究发现松针抗菌物可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和啤酒酵母的生长，但对青霉菌和黑曲霉则没显示出抑菌效果。松树皮多酚可以较好的抑制幽门螺杆菌的生长，半数致死浓度为12.5mg/mL.。此浓度下连续作用3h后，使幽门螺杆菌的生长减少了10%，胃癌细胞的附着力减少70%。法国沿海松树提取物碧萝芷对丙肝病毒复制有干扰作用，碧萝芷在野生型丙肝病毒复制减少HCV子细胞，RNA水平没有显著增加细胞毒性，因此碧萝芷可以抑制甚至消除抗丙肝病毒突变体^[13]。

（四）抗癌：符群等研究红松种鳞多酚对人肺腺癌细胞A549具有较好的抑制效果，0.4mg/mL浓度下抑制率可达到55%. Huynh H T等研究发现，海岸松树皮提取物能明显抑制亚硝胺在肝微粒体中的糖及还原和α羟基化作用，除此之外多酚提取物抑制肺微粒中N氧化途径。

（五）抗辐射：松科植物的多酚类物质具有较强的吸收紫外波长的能力，其抗辐射功能主要体现在抗紫外能力上，因此松多酚具有抗辐射和阻止皮肤黑色素的生成的能力，可以作为抗辐射剂和防晒剂。王吉昌将红松多酚给小鼠喂食后，可以防止辐射对小鼠免疫器官胸腺和肝脏的损害，能够有效地增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活力，并能降低过丙二醛的含量。松科树皮提取物能够缓解太阳紫外线诱发的皮肤红斑，Claude Saliou等研究了碧萝芷物对紫外线诱发的皮肤红斑具有保护作用，口服补充碧萝芷可以减少皮肤上的红斑^[13]。

（六）降血糖降血脂：刘红煜等研究发现松针总黄酮可以使大鼠抗氧化酶( SOD、GSH－Px、CAT) 活性上升，MDA含量下降，抑制脂质过氧化反应和自由基的产生，并能调节血脂代谢，对糖尿病、高血压、动脉硬化等一系列并发症具有较好的防治作用。

综合以上文献可知，松针多酚具有较高的医用价值，其活性成分的研究也应用广泛。是一种集观赏、环境保护及多种药用活性功能于一体的优良树木，相关研究者也对其进行了广泛的研究。

1.3 研究目的

优化马尾松松针多酚的提取工艺，并进一步对其抗氧化及抑菌活性进行研究，以期为马尾松松针资源的开发利用奠定基础。

1.4 研究意义

松科植物在我国分布广泛，含有多种活性成分，有极高的药用价值和商业价值。近年来研究发现松科植物体内含有大量多酚类物质，可以说是含有多酚类物质最丰富的植物之一，具有一系列独特的化学性质和生物活性，统称为松多酚，该类物质具有清除体内自由基、抑制脂质过氧化、抗炎镇痛、抗菌抗病毒、抗癌抗肿瘤以及抗辐射等多种生理活性，能够起到降血糖、降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗血栓及增强机体免疫功能的作用，可广泛应用于食品、医药、化妆品、保健品及高分子材料等领域^[16]，具有极高的经济价值和研究价值。马尾松种植面积广泛，是南方主要的松属植物，易于获得^[17]。而松针具有生长速度快、春夏秋冬四季均可采收，天然积蓄量大等优点，是高效的可持续利用的天然绿色再生资源^[18]。综上考虑我们选择马尾松松针作为实验原料，探究如何更好的提取出松针中的有效成分，研究其最佳提取条件，优化提取工艺并对其生物活性进行探索，为后续的开发利用更好的提供依据。这也表明在一定程度上开发该地区马尾松原材料在生活、工业中的应用，提供了本地区工业、经济进一步发展的可能性，有一定的经济意义^[17]。

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