镧络合物对酸雨胁迫下黄瓜生理指标的影响开题报告

研究方法、步骤:

模拟酸雨的配置: 根据苏州地区酸沉降水平，模拟配置酸雨，试验设pH=2.0，酸雨的化学组成，与目前苏州地区酸雨组成相近。

实验设3种处理，分别为对照、酸雨、镧 酸雨（镧为20mg/L)，各处理重复3次。喷施稀土24h后进行酸雨胁迫，按硫酸：硝酸体积比4.8：1配制模拟酸雨，pH为2.0，喷施于黄瓜叶片上。酸雨处理结束24h后进行测定，胁迫1、3、5d后取黄瓜叶片测定各项指标。

硝酸还原酶使用活体法；超氧化物歧化酶使用邻苯二酚自氧化法；过氧化物酶使用比色法；过氧化氢酶使用紫外法；丙二醛含量测定使用MDA测定方法；脯氨酸含量测定使用水溶浸提法。

硝酸还原酶（NR）:活体法测定，NR是植物氮素代谢作用中的关键性酶，与植物吸收和利用氮肥有关。它作用于三价硝酸根使之还原成二价硝酸根；产生的二价硝酸根可以从组织内渗透到外界溶液中，并累积在溶液中，测定反应液中二价硝酸根含量的增加，即表现该酶活性大小。二价硝酸根含量的测定用磺胺[对氨基苯磺酸胺（sulfanil-amide）]比色法。在酸性溶液中磺胺与二价硝酸根形成重氮盐，再与α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料。反应液的酸度大，则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮化盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每毫升含0.5μg的NANO2。活体法是直接用鲜活的组织进行测定，不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无须外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应做一定量的重复。

超氧化物歧化酶活性（SOD）：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，内含 2mmol/L EDTA)；0.2mol/L Tris(内含 4mmol/L EDTA)100ml与0.2mol/L HCl44.76ml混合，加双蒸水至 200ml，调 pH8.2±0.01；邻苯三酚(45mmol/L)：以 10mmol/LHCl 配制成 6mmol/L溶液，存放于冰箱备用; 在试管中按表加入缓冲液和双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的邻苯三酚(对照管用10mmol/L盐酸代替)，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长 325nm 处每 30s 测定一次吸光值 A0

SOD 活性测定法按上述表操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量 SOD，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述相同，所测吸光度为

过氧化物酶（POD）含量:比色法测定，POD广泛分布于植物的各个器官中。在有过氧化氢存在下，POD能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。用KH2PO4提取粗酶液，离心取上清。于分光光度计470nm波长测量OD值，每隔1min读数一次。以每分钟OD变化值表示酶活性大小，即以△OD470/minmg蛋白质（或鲜重g）表示。

过氧化氢酶的含量：酶液提取：是取新鲜植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表顺序加入试剂。3.25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按公式计算酶活性。以每克鲜样品1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。过氧化氢酶活性(u/g/min)=Δ

丙二醛含量：硫代巴比妥酸法测定，丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3,5,5—三甲基恶唑2,4-二酮)，在532nm处有最大光吸收，在600nm处有最小光吸收该复合物的吸光系数为:155[mmol/( L.cm )]，可按公式：A532－A600=155000×C×L算出MDA浓度进一步算出单位重量鲜组织中 MDA 含量(μmol/g)。式中，A532和A600分别表示532nm和600nm处的吸光度值。L为比色杯厚度(cm）

叶绿素含量：活体法测定，用叶绿素仪即可。

脯氨酸含量:磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

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