镧络合物对酸雨胁迫下蚕豆生理指标的影响开题报告

1. 研究目的与意义

背景：

稀土元素是一种新型的生长调节剂其中镧是最重要最活泼，具有提高作物逆抗性，增强作物抵御逆境伤害的生物学作用。

我国许多城市和地区普遍出现酸雨现象，苏州是江苏酸雨发生频次和程度最严重的地区。酸雨对植物的危害表现在直接影响和间接影响.直接影响是直接作用于植物全身; 间接影响体现在土壤酸化后结构、营养成分、通气等的劣化。

2. 研究内容和预期目标

研究内容：

本课题以主要粮食作物蚕豆为研究对象，利用一定浓度的镧络合物对幼苗期的材料进行叶面喷施，研究酸雨对幼苗期蚕豆的影响及验证镧络合物的抗逆效果，为研究酸雨的危害提供丰富的基础数据，为进一步在苏州地区推广使用镧络合物减轻酸雨危害和发现一种减轻酸雨危害新型合成物打下基础。指标包括：叶绿素含量、mda（丙二醛）含量、pod（过氧化物酶）活性、sod（超氧化物歧化酶）活性、cat（过氧化氢酶）活性、nr（硝酸还原酶）活性、脯氨酸含量、氧自由基产生速率、质膜透性等。

预期目标：研究酸雨对蚕豆幼苗的伤害；研究镧的络合物的抗逆效果

3. 研究的方法与步骤

研究方法、步骤：

一、实验如何分组：将实验培育正常生长的蚕豆幼苗各项指标作为对照组；将经过不同浓度酸雨喷洒影响后的蚕豆幼苗作为观察组(10组每组7株)；将不同浓度经镧的络合物影响后的蚕豆幼苗作为样品组（10组每组5株）。

1、种子的培养（对照组）：0.5％次氯酸钠消毒5min，再用无菌水清洗3次后晾干，培养皿中放两层充分湿润的滤纸，将种子平铺于滤纸上，加入适当无菌水，放置于温度25℃，12h光照/12h黑暗培养箱中。

2、模拟酸雨的配置: 根据苏州地区酸沉降水平，模拟配置酸雨，试验设pH (蒸馏水与大气平衡后形成的溶液，其pH=5.6) pH=5.6，

3、模拟酸雨影响（观察组）：待发芽的幼苗移栽8小时后，开始喷洒模拟酸雨每3d喷洒1次每次每培养皿240ml，主要喷洒在植物的顶部，叶片观察记录植物的受害症状。

4、幼苗的培养（影响组）：为了研镧元素的抗逆效果，以便于找出最适浓度，我们发芽的经不同外界影响因素下的幼苗浸种在LaCl3溶液中。一段时间后测定其各项指标。

5、生理指标的测定：

（1）叶绿素含量：用叶绿素仪测定。

（2）MDA（丙二醛）含量：硫代巴比妥酸法测定 丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川，在532nm处有最大光吸收，在600nm处有最小光吸收该复合物的吸光系数为:155[mmol/(L.cm)]，可按公式：A532－A600=155000×C×L算出MDA浓度进一步算出单位重量鲜组织中 MDA 含量(μmol/g)。式中，A532和A600分别表示532nm和600nm处的吸光度值。L为比色杯厚度(cm)

（3）POD（过氧化物酶）活性：愈创木酚法 在过氧化物酶(POD)催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物此产物在470nm处有最大光吸收值，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。取1~5克洗净的蚕豆幼苗叶片切碎放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，将匀浆液全部转入离心管中离心，上清液转入容量瓶中。上清液并入容量瓶中定容至刻度，加热煮沸为对照，反映体系加入酶液后，立即于37度水浴中保温15分钟，然后迅速转入冰浴中，并加入23%氯乙酸两ml终止反应，然后过滤（或5000rpm/min离心10min）适当稀释，470nm波长下测定吸光度。

以每分钟内A470变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位(U)。

:△A470——反应时间内吸光度的变化；

W——样品鲜重 (g)；

t——反应时间(min)；

VT——提取酶液总体积(mL)；

VS——测定时取用酶液体积(mL)

（4）SOD（超氧化物歧化酶）活性：

Tris-HCl 缓冲液

邻苯三酚

在试管中按表加入缓冲液和双蒸水，加入预热过的邻苯三酚(对照管用盐酸代替)，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长 325nm 处测定一次吸光值 A0

SOD 活性测定法按上述表操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量 SOD，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述相同，所测吸光度为A（SOD）=（A0-ASOD）/A0*100%

（5）CAT（过氧化氢酶）活性：称取新鲜蚕豆幼苗叶片或其它植物组织置研钵中，加入磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入容量瓶中并定容到刻度。混合均匀，将两瓶置冰箱中静置，取上部澄清液离心。取三支试管其中两支为样品测定管。一支为空白管。按下表加入试剂。

25度预热后，主管加入双氧水，每加完一管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中测定吸光度，全部测定完后按下式计算酶活力

以1min内A240减少0.1的酶量为一个酶活单位

过氧化氢酶活力=A240*Vt/0.1*t*V1*FW

式中A240=As0-（As1-As2）/2

As0-对照管吸光值

As1.As2-样品管吸光值

VT-粗酶提取液总体积

V1-测定用粗酶液体积

FW-样品鲜重

0.1-A240每下降0.1为一个酶活单位

t-加过氧化氢到最后一次读数时间

(6)NR（硝酸还原酶）活性

将蚕豆幼苗叶片剪碎称取两份放入烧杯中，一个烧杯中加磷酸缓冲液5ml再加入蒸馏水，作为对照组。另一个烧杯中加入磷酸缓冲液和KNO3溶液作为实验组。将材料与溶液混合置于射器中抽气至材料沉入溶液。将含材料的烧杯置于30℃恒温箱中之后分别取1ml溶液别加入磺胺、α-奈氨摇匀静置，在520nm处比色以NaNO2终浓度为横坐标绘制标准曲线测出NO2含量。

酶活性=（实验组NO2-含量-对照组NO2-含量）/材料重量（g）/时间（h）

（7）质膜透性：

将蚕豆幼苗叶片用自来水冲洗干净后，用干净纱布擦干净，用打孔器打取圆片，放入三个小烧杯中：一份冰箱中做低温处理，一份放入恒温箱中做高温处理，另一份包在湿纱布中做室温放置作为对照在各烧杯中加入20ml去离子水，浸没叶圆片，用真空泵抽出细胞间隙空气，然后缓缓放入空气，水渗入细胞间隙，叶片变成半透明状下沉。用电导仪测定各组的初电导率（S1），将烧杯放入100度沸水浴中杀死植物组织，取出后冷却之室温分别测定其终电导率（S2），同时测定去离子水的电导率作为空白电导率（S0）

4. 参考文献

[1]王开峰，廖柏寒，刘红玉，等.模拟酸雨和zn复合污染对蚕豆生长及其生理生化特性的影响[j].环境科学学报，2005,25（02）：203-207

[2]于秋良,李忠芳,唐政,等.模拟酸雨胁迫条件下稀土元素对玉米植株的生物学效应[j].贺州学院学报,2015,31(3)：151-156.

[3]李岳丽,王雯,王丽红,等.环境中镧对水稻叶绿体功能元素的影响[j].稀土.2015,32(12)：107-112.

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-1学期17-19周及2022-2022-2学期第1周-第3周（2022-12-23~2022-3-13），查阅资料和文献，准备开题报告，外文论文翻译；

（2）第4周-第8周（2022-3-16~4-17），浸种，培养实验材料，摸索实验方法；

（3）第9周-第12周（2022-4-20~2022-5-15），培养植物幼苗，确定实验方法，确定酸雨及镧络合物的施用方法及浓度，测定生理指标；