镧络合物对酸雨胁迫下大豆生理指标的影响开题报告

1. 研究目的与意义

酸雨是全球性的污染源之一，已经成为重要的国际环境问题。继西欧和北美以后，我国成为世界第三大酸雨区，酸雨面积已经超过国土面积的百分之四十，给我国的农业生产带来巨大影响。根据宏观分析显示，酸雨是危害植物地上，地下器官两个层面上，后者又是以土壤环境酸化为背景。酸雨能加速土壤矿物质营养元素的流失，改变土壤结构，导致土壤贫瘠化。研究酸雨对农作物的危害迫在眉睫。 近年来稀土农用研究发现，适当的稀土，在促进作物优质增产的同时，还有诱导植物抗性的能力。稀土元素是一种新型生长调节剂，其中镧最重要，最活泼，最具有提高作物抗逆性和增强作物抵御逆境伤害的生物学作用。 酸雨胁迫下镧对大豆种子萌发期间多项生理指标的研究表明，在一定程度的酸雨胁迫下，镧能够缓解对大豆种子的伤害，促进种子萌发。有鉴于此，本文初步考查了镧络合物对酸雨胁迫下大豆生理指标的影响，为进一步了解酸雨对作物的危害及减轻酸雨对作物的伤害提供参考。

2. 研究内容和预期目标

研究内容： 本课题在研究酸雨胁迫下，大豆幼苗的生长受到抑制，生理机能受到影响。镧络合物能提高作物抗逆性能力的机理作用。从酸雨对植物酸致伤害机理，光合抑制效应和自由基效应入手，通过探索因为酸雨胁迫下导致作物细胞内叶绿素含量、MDA（丙二醛）含量、POD（过氧化物酶）活性、SOD（超氧化物歧化酶）活性、CAT（过氧化氢酶）活性、NR（硝酸还原酶）活性、脯氨酸含量、氧自由基产生速率、质膜透性等的变化。来确定镧络合物对酸雨胁迫下大豆生理指标的影响。 预期目标： 理解酸雨和镧络合物。测定出大豆的生理指标。学习探索酸雨中对幼苗的主要影响元素以及作用原理。通过实验数据分析得出镧络合物如何对酸雨胁迫下作物进行修复的方法。

3. 研究的方法与步骤

拟采用水培法研究镧络合物对酸雨胁迫下大豆生理指标的影响。

实验设3种处理，分别为对照组、酸雨组、酸雨＋稀土组，各处理重复三次。喷施稀土24h后进行酸雨胁迫。按照硫酸：硝酸体积比为4.8：1配置模拟酸雨，PH为3.5。步骤：1.大豆种子的培养 种子经过0.1%HgCl2消毒十分钟后洗净，离子水浸泡24h后将种子整齐排列在铺有滤纸的培养皿中，随后放入光照箱萌发培养。大约八天左右移入完全营养液中，每份培养液中5株，每三天更换营养液，三周后处理。2.模拟酸雨的制备3.最佳镧络合物浓度的筛选4.喷洒最适浓度镧络合物，24小时后喷ph值为3.5的模拟酸雨，结束后24小时进行下一步。5.各项指标测定。叶绿素含量、MDA（丙二醛）含量、POD（过氧化物酶）活性、SOD（超氧化物歧化酶）活性、CAT（过氧化氢酶）活性、氧自由基产生速率、质膜透性、脯氨酸含量、NR（硝酸还原酶）活性等各项指标测定。

①叶绿素含量的测定

用叶绿素仪直接测定。

②MDA(丙二醛)含量测定：

丙二醛是常用的膜脂过氧化指标。丙二醛为提取液，吸取2ml提取液于刻度试管中，加入0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml，于沸水浴加热10min，迅速冷却。于4500转/min离心10min。取上清液于532、600和450nm波长下的消光度。

结果计算：

按照双组分分光光度法原理，建立方程组，即可求出MDA及可溶性糖浓度。

提取液中MDA浓度=CMDA×反应液体积/1000/测定时提取液用量

MDA含量=提取液中MDA含量×提取液总量/植物组织鲜重

其中CMDA为反应混合液中MDA浓度。

③POD(过氧化物酶）活性测定： （1）粗酶液的提取:称取植物材料0.4-0.5g，加磷酸缓冲液(7.8)5ml(分几次加入)，于研钵中研磨成匀浆，以8000r/min离心10min，收集上清液于冷处(冰箱4度保存)。 （2）酶活性的测定:一个试管入反应混合液3ml，磷酸缓冲液(7.8)1ml，作为校零对照，另外加入反应混合液3ml，上述酶液1ml，立即开启秒表计时，于470nm测吸光值，每隔15秒读1次值，读45秒，以为每15秒钟吸光变化值测酶活性的大小。 （3）计算公式 POD= (ΔA470×Vt)/ (W×Vs×0.01×t) (u/g min)

ΔA:反应时间内吸光值的变化470 W:样品重量 V:提取液总体积，即5ml Vt:测定时所用体积,即1ml t:反应时间 注意:一般来说，都需要稀释，如果酶液稀释了，应在计算时乘上相应的倍数。

④SOD(超氧化物歧化酶)活性测定（邻苯三酚自氧化法）

邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H 结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。

步骤：

(1)SOD提取

(2)除杂蛋白

(3)SOD酶的沉淀分离

(4)粗酶液活性测定

(5)溶液中可溶性蛋白含量测定

⑤CAT(过氧化氢酶）活性测定：

称取新鲜大豆幼苗叶片置研钵中，加入磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入容量瓶中并定容到刻度。混合均匀，将两瓶置冰箱中静置，取上部澄清液离心。取三支试管其中两支为样品测定管。一支为空白管。按下表加入试剂。

25度预热后，主管加入双氧水，每加完一管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中测定吸光度，全部测定完后按下式计算酶活力

酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：

酶活(mg/g/min)=(A-B)×VT/VS×1.7/W×t

A—对照组KMnO4滴定毫升数；

B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；

VT—酶液总量（ml）；

V1—反应所用酶液量（ml）;

W—样品鲜重（g），本实验为2.5g。

1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。

t—反应时间，本实验为10min。

⑥氧自由基产生速率：

(1)提取液制备：

称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中,加入50mmo1 /L磷酸缓冲液(ph7. 8) 5ml,研磨成匀浆,在1000r/min,4℃离心10min,取上清液再以15000r/min，4℃下离心20min,第二次上清液即为样品提取液.

(2)亚硝酸根标准曲线的制作

(2.1)系列浓度NaNo2溶液的配制

取50nmol/mlNaNo2母液,分别稀释成0、10、20、30、40和50nmol /m1的标准稀释液。取7支试管,编0~6号,分别加10、15、 20、30、40、 50nmol /mlNaNO2标准稀释液1ml, 0号管加蒸馏水1ml,然后各管再加50mmol /L磷酸缓冲液Iml, 17mmol /L对氨基苯磷酸1ml和7 mmol /La一萘胺1ml,置于25℃显色20min后,以0号管作空白对照,在530nm波长处测定吸光度(A)值.

(2.2)标准曲线绘制

以1-6号管亚硝酸根(No2-)浓度为横坐标,吸光度值作纵坐标,绘制标准曲线.

(3)O2-含量测定

取4支试管,编0~3号, 1~号管分别加入样品提取液0.5ml (三个重复), 0号管加蒸馏水0.5ml,然后各管加入50mmo1 /L磷酸缓冲液0. 5ml, 1 mmol/ L盐酸羟胺1ml,混匀,置于25℃ 1 h后,各管再加入17 mmol /L对氨基苯磺酸1m1和7mmol /La一萘胺1ml,混匀,置于25℃显色20min，以0号管为空白对照,在530mm波长处测定吸光度(A)值。

(4)结果计算：

根据所测得的A530值,从标准曲线上查得样品中NO2-浓度,按公式即可计算出样品中NO2-浓度,然后依据羟胺与O2-的上述反应,从NO2-对O2-进行化学计量,按公式计算,即将按公式计算得到的NO2-浓度乘2,得O2-浓度。

NO2-含量=从标准曲线查得NO2-×提取液总量/样品重/测定时提取液用量

O2-含量=NO2-×2

⑦细胞质膜透性

将大豆幼苗叶片用自来水冲洗干净后，用干净纱布擦干净，用打孔器打取圆片，放入三个小烧杯中：一份冰箱中做低温处理，一份放入恒温箱中做高温处理，另一份包在湿纱布中做室温放置作为对照在各烧杯中加入20ml去离子水，浸没叶圆片，用真空泵抽出细胞间隙空气，然后缓缓放入空气，水渗入细胞间隙，叶片变成半透明状下沉。用电导仪测定各组的初电导率（S1），将烧杯放入100度沸水浴中杀死植物组织，取出后冷却之室温分别测定其终电导率（S2），同时测定去离子水的电导率作为空白电导率（S0）

相对电导率：（L）=（S1-S0）/（S2-S0）质膜透性越大相对电导率越大。

⑧脯氨酸含量测定

脯氨酸含量在一定程度上反应了植物的抗逆性。当用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度,即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

⑨NR（硝酸还原酶）的测定（活体法）

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：

生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Nμg·g-1·h-1为单位。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。

方法：

(1)标准曲线制作

取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。

(2)酶反应和酶活性测定

(2.1)取样：将作物叶片洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干。在叶片中部打取直径1cm的圆片（或剪成0.5~1.0cm2的小块），混匀后每个样品称0.5~1.0g 3份，放入试管并编号。

(2.2)反应：向各试管加入KNO3·异丙醇·磷酸缓冲液混合液9ml，其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混匀作对照。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。将各试管置30℃下于黑暗处保温30min，分别向处理管加1.0ml三氯乙酸，摇匀终止酶活性。

(2.3)比色：将各试管静置2min，吸取上清液2ml加入另一组试管，以对照管做参比，按标准曲线做法进行显色测定，并计算酶活性（Nμg·g-1·h-1）。

式中 C：反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg）； V1：提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）； V2：酶反应时加入的粗酶液体积（ml）； W：样品重量（g）；t：反应时间（h）。

4. 参考文献

[1]严重玲,洪业汤.稀土元素对酸雨胁迫小麦抗氧化酶的生物学效应[j].科学通报,1998,43(20):2206-2209.[2]严重玲,洪业汤.稀土元素对酸雨胁迫小麦活性氧清除系统响应的作用[j].作物学报,1999,25(4):504-507.

[3]张杰,黄永杰,刘雪云.镧对镉胁迫下水稻幼苗生长及生理特性的影响[j].生态环境,2007,16(3):835-841.

[4]刘恩侠.稀土对向日葵种子萌发与根系生长的影响[j].稀土,1996,17(3):64-66

5. 计划与进度安排

合理安排实验进度：

（1）2022-2022-1学期17-19周及2022-2022-2学期第1周-第3周（2022-12-23~ 2022-3-13），查阅资料和文献，准备开题报告，外文论文翻译；

（2）第4周-第8周（2022-3-16~ 4-17），浸种，培养实验材料，摸索实验方法；