用于分散蛋白B一步纯化与固定化的金属螯合磁珠的研制开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述）

一.研究背景介绍（生物被膜相关感染以及分散蛋白B） 生物被膜是一种由细菌群体及自身分泌的胞外聚合物基质组成的多层网状结构集合体[1]，其固着于细菌存在的物体或活性组织表面，对细菌生长起到机械支撑保护功能，同时介导细菌之间以及细菌与外界环境之间的相互作用。成熟的生物被膜通过这种高度组织化的多层复合结构可以有效的降低多种抗菌剂的渗透，使细菌菌群对抗菌物质产生抗性，并且能抵抗多种免疫分子的作用，从而逃避体免疫系统的清除。因此，临床上生物被膜形成加大病人术后持久性细菌感染的风险，并引起相关炎症并发症的发生[2]。 细菌分泌的胞外聚合物基质的主要成分为多糖，其中一种名为细胞间多糖黏附素（PIA，Polysaccharide Intercellular Adhesion）的己糖胺类基质多糖被发现存在于多种葡萄球菌以及大肠杆菌中，其是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖为基本单元，通过β（1，6）糖苷键连接形成的直链结构[3]。通过降解细胞外多糖，阻断生物被膜形成或降解生物被膜结构，是解决生物被膜相关感染问题一个很好的切入角度[4-5]。 分散蛋白B（DspB，Diserpin B）是一种分离于牙周放线共生放线杆菌的N-乙酰葡萄糖苷酶，其作用于β（1，6）连接的N-乙酰葡萄糖，能从PIA的非还原性末端移除末端N-乙酰葡萄糖苷残基[6]。由于DspB这一特殊的催化性质，从而可以作为处理生物被膜感染潜在的抗菌剂。Darouiche[7]等人将DspB与三氯生联用，对医用导管进行预涂处理，并将其放置在牛血清一段时间后分析细菌菌落情况，结果显示相比于单纯三氯生或者是氯己定银磺胺嘧啶（CH-SS，chlorhexidine–silver sulfadiazine）处理，DspB与三氯生联用显示出显著的减少金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌等多种细菌增殖的效果（p0.05），且具有较长的抗菌活性。Chen Kuanjung[8]等人在DspB上融合表达银结合肽，可在原位诱导银纳米颗粒的形成，。针对表皮葡萄球菌生物被膜，DspB与银结合肽融合表达蛋白可清除约69%生物被膜，显著抑制生物被膜的形成。二、金属螯合磁珠应用于DspB的一步纯化与固定化 金属螯合磁珠是一类表面固定有金属离子的磁性微粒，其结合了固定化金属螯合层析（IMAC，immobilized-metal affinity chromatography）与功能化磁性纳米颗粒的特点[9]。通过金属离子与蛋白质表面氨基酸残基的配位作用实现对目标蛋白的特异性结合，施加外加磁场，可以方便快速的分离获得目标蛋白，同时也同步实现了目标蛋白的固定化。金属螯合磁珠作为固定化载体的优势主要有以下几点：（1）固定化方法简单快捷，可直接从细胞裂解液中固定目标蛋白，实现目标蛋白的一步纯化与固定化（2）金属螯合磁珠粒径较小，比表面积高，从而具有较高的酶载量（3）磁珠具有超顺磁性以及较高的磁响应性，便于回收利用以及固定于固相载体。（4）靶向的方便性，在外加磁场作用下，载体可以快速定向移动到目标位置。因此金属螯合磁珠被广泛应用于重组蛋白的纯化以及固定化中[10-11]。 金属螯合磁珠应用于固定化的最大特点在于其固定化操作不需要大量的前处理以及纯化过程，从而可以大大降低成本。Yang[12]等人在四氧化三铁纳米颗粒上包裹多巴胺层，并螯合Ni2 ，成功应用于转氨酶的一步纯化固定化。磁珠固定化转氨酶热稳定性以及pH耐受均有所提高，酶催化的特异性也有提高。三、金属螯合磁珠的合成 金属螯合磁珠的合成一般以核壳结构磁珠为主，核壳结构金属螯合磁珠在结构上从内到外可以分为磁性内核、基底层、螯合配体和金属离子四部分。磁性材料包括纯金属（如Fe、Co）、金属氧化物（如γ-Fe2O3、Fe3O4）、尖晶石型铁磁体（如MgFe2O4、MnFe2O4、CoFe2O4）、合金（如CoPt3、FePt）等[13]。其中以Fe3O4以其良好的生物相容性、容易制备以及磁响应性好等特点使用最为广泛。 基底层材料的选择分为有机材料与无机材料两类。无机材料主要包括二氧化硅、碳、纯金属（如Au、Ag）、金属氧化物/硫化物 (如ZnO、ZnS、TiO2、Cu2O等)，其中二氧化硅使用最为广泛。有机材料则主要包括壳聚糖、海藻酸钠等天然聚合物，聚苯乙烯、聚酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯等合成聚合物以及油酸、多巴胺等有机小分子。 常用的螯合配体包括氨基三乙酸（Nitrilotriacetic acid，NTA）、亚氨基乙二酸（Iminodiacetic Acid ，IDA）和三（羧甲基）乙二胺（Tricarboxymethyl ethylenediamine ，TED）、羧甲基天冬氨酸（Carboxymethylasparticacid，CM-Asp）等。这些小分子大多含有多个羧基以及氨基，能与金属离子形成稳定的五元或者六元配位环。其中NTA以及IDA是使用最多的螯合配体[14-15]。通常在连接螯合配体时，在磁珠与螯合配体之间加入双功能试剂作为延伸臂。常用于起桥连作用的双功能试剂包括戊二醛、环氧氯丙烷、乙二胺以及硅烷偶联剂等。 由于金属离子半径、所带电荷、电子层结构不同，对蛋白质的亲和力也有所差异。目前应用于重组蛋白分离纯化以及固定化中的金属离子主要是过渡金属金属一类，包括Zn2 、Cu2 、Ni2 和Co2 。四、本研究的目的与意义 本研究的主要目的在于制备一种或多种新型金属螯合磁珠，并将其用于重组DspB的一步纯化与固定化，所制备固定化酶可以有效分散生物被膜，达到良好的抑菌效果。本研究的意义在于目前常规的抑菌、除菌剂并不能很好的抑制或清除成熟的生物被膜。金属螯合磁珠固定化DspB通过酶解反应分散生物被膜，可以达到良好的抑菌效果。该研究为应对生物被膜感染提供了一种有意义的参考方法，也为之后分散蛋白B的进一步应用打下了基础。此外，所制备的金属螯合磁珠可以应用于多种组氨酸标签蛋白的固定化酶体系中，简化了固定化过程，为酶的固定化提供了一种新的途径。参考文献[1] Costerton; W., J., Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. 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2. 研究的基本内容与方案

2.1 研究内容与目标

本研究的主要目标在于：

（1）制备一种或多种新型金属螯合磁珠，粒径分布均匀，具有良好的磁响应性以及超顺磁性。同时所制备磁珠应可以高特异性结合重组dspb。

3. 研究计划与安排

第一阶段：准备阶段

2019年9月——10月

（1） 确定研究课题，查阅并整理相关文献

4. 参考文献（12篇以上）

[1] Costerton; W., J., Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science 1999, 284 (5418) :1318-1322.[2] Tan, Y.; Ma, S.; Liu, C.; Yu, W.; Han, F., Enhancing the stability and antibiofilm activity of DspB by immobilization on carboxymethyl chitosan nanoparticles. Microbiol Res 2015, 178 :35-41.[3] Del Pozo, J. L., Biofilm-related disease. Expert Rev Anti Infect Ther 2018, 16 (1) :51-65.[4] Kaplan, J. B.; Velliyagounder, K.; Ragunath, C.; Rohde, H.; Mack, D.; Knobloch, J. K.; Ramasubbu, N., Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms. J Bacteriol 2004, 186 (24) :8213-8220.[5] Sutherland, I. W., Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology 2001, 147 (1) :3-9.[6] Vuong, C.; Voyich, J. M.; Fischer, E. R.; Braughton, K. R.; Otto, M., Polysaccharide intercellular adhesin (PIA) protects Staphylococcus epidermidis against major components of the human innate immune system. Cellular Microbiology 2004, 6 (3) :269-275.[7] Elchinger, P. H.; Delattre, C.; Faure, S.; Roy, O.; Badel, S.; Bernardi, T.; Taillefumier, C.; Michaud, P., Effect of proteases against biofilms of staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Letters in Applied Microbiology 2014,59 (5) :507-513.[8] Lamppa, J. W.; E., A. M.; I., L. J.; C., S. T.; E., G. K.; Roop, I. R., Genetically Engineered Alginate Lyase-PEG Conjugates Exhibit Enhanced Catalytic Function and Reduced Immunoreactivity. PLoS One 2011,6 (2), e17042.[9] Kaplan, J. B.; Ragunath, C.; Ramasubbu, N.; Fine, D. H., Detachment of Actinobacillus actinomycetemcomitans biofilm cells by an endogenous beta-hexosaminidase activity. J Bacteriol 2003, 185 (16):4693-4698.[10] Manuel, S. G. A.; Ragunath, C.; Sait, H. B. R.; Izano, E. A.; Kaplan, J. B.; Ramasubbu, N., Role of active-site residues of dispersin B, a biofilm-releasing β-hexosaminidase from a periodontal pathogen, in substrate hydrolysis. 2007, 274(22):5987-5999.[11] Kerrigan, J. E.; Ragunath, C.; Kandra, L.; Gyemant, G.; Liptak, A.; Janossy, L.; Kaplan, J. B.; Ramasubbu, N., Modeling and biochemical analysis of the activity of antibiofilm agent Dispersin B. Acta Biol Hung 2008, 59 (4):439-51.[12] Kaplan, J. B.; Ragunath, C.; Velliyagounder, K.; Fine, D. H.; Ramasubbu, N., Enzymatic detachment of Staphylococcus epidermidis biofilms. Antimicrob Agents Chemother 2004, 48 (7) :2633-2636.[13] Darouiche, R. O.; Mansouri, M. D.; Gawande, P. V.; Madhyastha, S., Antimicrobial and antibiofilm efficacy of triclosan and DispersinB combination. J Antimicrob Chemother 2009, 64 (1) : 88-93.[14] Chen, K. J.; Lee, C. K., Twofold enhanced dispersin B activity by N-terminal fusion to silver-binding peptide for biofilm eradication. Int J Biol Macromol 2018, 118 (Pt A), 419-426.[15] Katchalski-Katzir, E., Immobilized enzymes — learning from past successes and failures. Trends in Biotechnology 1993, 11 (11) :471-478.[16] Homaei, A. A.; Sariri, R.; Vianello, F.; Stevanato, R., Enzyme immobilization: an update. J Chem Biol 2013, 6 (4) :185-205.[17] 郑璐. 海藻酸钠固定化α-淀粉酶的研究. 华中农业大学, 2013.[18] Cao, S.-L.; Xu, H.; Li, X.-H.; Lou, W.-Y.; Zong, M.-H., Papain@Magnetic Nanocrystalline Cellulose Nanobiocatalyst: A Highly Efficient Biocatalyst for Dipeptide Biosynthesis in Deep Eutectic Solvents. ACS Sustainable Chemistry Engineering 2015, 3 (7) :1589-1599.[19] Brena, B.; Gonzalez-Pombo, P.; Batista-Viera, F., Immobilization of enzymes: a literature survey. Methods Mol Biol 2013, 1051 :15-31.[20] Jesionowski, T.; Zdarta, J.; Krajewska, B., Enzyme immobilization by adsorption: a review. Adsorption 2014, 20 (5-6) :801-821.[21] 张艳. 纳米材料固定化酶体系的构筑及其在电化学传感器中的应用. 上海交通大学.[22] Hwang, E. T.; Gu, M. B., Enzyme stabilization by nano/microsized hybrid materials. Engineering in Life Sciences 2013, 13 (1) :49-61.[23] Jiang, Y.; Wu, Y.; Li, H., Immobilization of Thermomyces lanuginosus Xylanase on Aluminum Hydroxide Particles Through Adsorption: Characterization of Immobilized Enzyme. J Microbiol Biotechnol 2015, 25 (12) :2016-2023.[24] Bedade, D. K.; Sutar, Y. B.; Singhal, R. S., Chitosan coated calcium alginate beads for covalent immobilization of acrylamidase: Process parameters and removal of acrylamide from coffee. Food Chem 2019, 275 :95-104.[25] 乔醴峰. 基于核酸适配体的β-葡萄糖醛酸苷酶一步纯化固定化研究及其应用. 石河子大学, 2015.