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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、课题意义：
土壤重金属污染已成为世界许多地区的严重问题[1][2]。在过去几十年社会和经济的快速发展之后，重金属对土壤的污染在中国既严重又普遍[3]。虽然重金属可能在土壤中自然产生，但主要来自人类活动，如农业，城市化，工业化和采矿等[1]。重金属对我国植物生长和人类健康造成了严重的危害。
前人研究发现，滇苦菜是一种超富集植物，对cd等具有较强的富集能力[4]。但目前对于滇苦菜的重金属耐性机制研究主要集中在生理水平上，分子水平上的机制研究甚少。
2. 研究的基本内容和问题
一、研究目标：
1.讨论毛连菜属下滇苦菜与毛连菜对锌和镉的表观遗传差异机制；
2. 比较不同群体滇苦菜与毛连菜对锌和镉胁迫的响应。
3. 研究的方法与方案
一、研究方法
1.查阅文献
2.实验法（MSAP法）
3.数据分析
二、技术路线
三、实验方案
1.基因组DNA酶切
对6个滇苦菜种群和2个毛连菜种群基因组DNA进行酶切（EcoRI HpaII，EcoRI MspI），37℃，3 h。体系如下。酶切结束后，80℃水浴20 min使酶灭活。
表1双酶切体系
| EcoRI HpaII reaction system |
| EcoRI MspI reaction system | ||||
| DNA(100 ng/μl) | 1.25 μl | DNA(100 ng/μl) | 1.25 μl | |||
| EcoRI (20 u/μl) | 0.25 μl | EcoRI (20 u/μl) | 0.25 μl | |||
| HpaII (10 u/μl) | 0.25 μl | MspI (20 u/μl) | 0.25 μl | |||
| Cutsmart buffer | 2.0 μl | Cutsmart buffer | 2.0 μl | |||
| ddH2O | 6.25 μl | ddH2O | 6.25 μl | |||
| total volume |
| 10 μl |
| total volume |
| 10 μl |
2.酶切产物接头复性
将E1，E2 EcoRI接头和HM1，HM2 HpaII/MspI接头复性形成双链。操作过程如下：先将接头稀释浓度到100 μM。EcoRI接头按照取2 μl E1 2 μl E2补水至40 μl，浓度为5 μM。HpaII/MspI接头按照20 μl HM1 20 μl HM2，浓度为50 μM。PCR复性程序：90℃，1.5 min；64循环，每一循环温度下降1℃；25℃，30 s；4℃保存。
3.酶切产物接头连接
按表2中体系加入各反应成分，混匀后16℃连接过夜。反应完成后70℃灭活10 min，4℃保存。
表2 接头连接体系
| Component | Volume |
| Restricted production | 10 μl |
| E1/E2(5 pM) | 0.25 μl |
| HM1/HM2(50 pM) | 0.25 μl |
| T4 DNA ligase(10 U/μl) | 0.125 μl |
| 10 × T4 DNA Ligase Buffer | 0.5 μl |
| ddH2O | 1.375 μl |
| Total volume | 20 μl |
4.预扩增
将T4连接产物稀释10倍。按表3中体系加入各反应成分。PCR程序如下：94℃，30 s；56℃，1 min；72℃，1 min；30个循环，4℃保存。
表3 预扩增体系
| Component | Volume |
| Ligation product | 3 μl |
| E01(50 ng/μl) | 0.6 μl |
| HM0(50 ng/μl) | 0.6 μl |
| Taq DNA polymerase | |
| PCRmix | 7.5 μl |
| ddH2O | 3.3 μl |
| Total volume | 15 μl |
5.选择性扩增
预扩增产物稀释10倍。按表4中体系加入各反应成分，选择性扩增引物对为荧光引物。PCR程序如下：94℃，30 s；65℃，30 s；72℃，1 min；12个循环，每1循环温度下降0.7℃；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，1 min；22个循环，4℃保存。
表4 选择性扩增体系
| Component | Volume |
| Ligation product | 3 μl |
| EcoRI-ive primer(50 ng/μl) | 0.6 μl |
| HPaII/MspI-ive primer(50 ng/μl) | 0.6 μl |
| Taq DNA polymerase | |
| PCRmix | 7.5 μl |
| ddH2O | 3.3 μl |
| Total volume | 15 μl |
6.荧光毛细管电泳
由于选择性扩增引物带有荧光，所以PCR产物也具有荧光特性。使用ABI 3730自动测序仪在一个泳道中同时运行3个标有不同颜色的产物以及1个标有橙色荧光的分析量内标。蓝色荧光标记为FAM，绿色荧光标记为HEX，黄色荧光标记为TAMRA，内标橙色荧光标记为TET。PCR产物荧光毛细管电泳在苏州金唯智生物公司完成。
7.数据分析
DNA样品经HpaII/EcoRI（H）和MspI/EcoRI（M）两种组合酶切后的产物有4种甲基化类型，但在荧光毛细管电泳分析中只能检测出3种甲基化类型：（1）H和M组合都有带，表明CCGG位点未甲基化；（2）H有带，M无带，表明CCGG位点发生单链外部甲基化（CHG甲基化/半甲基化）；（3）H无带，M有带，表明 CCGG位点发生双链内部甲基化（CG甲基化/全甲基化）。MSAP数据通过R语言msap package包进行。
4. 研究创新点
滇苦菜（PicrisdivaricataVaniot）是原产于中国的本土植物，繁殖能力较强，能够在重金属污染环境下良好生长，同时具有积累重金属镉和锌的能力。而其同属植物毛连菜（Picris hieracioides L.）则不能够在重金属污染环境下良好生长。目前，对于滇苦菜耐重金属的研究主要集中在生理机制上，如抗氧化酶活性上升等，其重金属耐性的表观遗传学研究甚少。我们利用MSAP技术，探讨重金属积累植物滇苦菜对重金属污染环境适应的进化机制。
5. 研究计划与进展
2018.10-2018.11：msap分子实验
2018.11-2019.01：利用genemarker进行测序结果分析，统计片段长度大小，获得0/1矩阵
2019.03-2019.04：进行0/1矩阵数据分析，获得相关结果
