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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
近年来，随着社会的快速发展，世界人口与日俱增，耕地数量不断减少，粮食问题十分突出。转基因作物的研究与开发能够有效提高作物产量以及农业生产的稳定性。国际农业生物技术应用服务组织（isaaa）年度报告的数据显示，从1996年转基因作物实现商业化生产到2017年，全球范围内转基因作物的种植面积已经达到1.898亿公顷，增加了112倍，除了玉米(zea mays)、棉花(gossypium hirsutum)、大豆(glycine max)和油菜(brassica napus)这四种主要作物以外，还有马铃薯、苹果等越来越多的转基因作物被投入市场[1]。目前转基因作物的研发主要集中于抗除草剂、抗虫和抗病性状等。
杂草一直是农业生产中面临的重要问题，它使农作物品质降低，产量下降。抗除草剂转基因作物的研发以及应用，不仅能够减少杂草防除的成本，增加农作物产量，还能降低除草剂对作物造成的伤害，减少环境污染[2]。20世纪80年代，bar基因和pat基因分别从吸水链霉菌（streptomyces hygroscopicus）和绿色链霉菌（streptomyces viridochromogenes）中分离，被广泛用于转基因技术赋予作物除草剂抗性[3]。
农作物在生产过程中不仅受到杂草的影响，虫害也严重影响着作物的产量，全球因虫害造成的农作物损失约为13，我国水稻每年损失估计为10[4]。虽然化学杀虫剂品种多，效率高，但几乎每一种杀虫剂都会对种群生态系统造成严重破坏，引起环境污染，其中大部分还会危害人体健康，因此开发抗虫作物用以代替化学杀虫剂至关重要[5]。1996年以来，全球范围内种植了很多转bt基因作物以控制害虫，产生单一毒素的转bt基因作物对鳞翅目和鞘翅目等害虫有显著的致死效果，目前在美国培育出了能产生多种毒素的转bt基因作物[6]。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：本试验以复合性状转cry2a*/bar基因水稻t2a-1与mh63分别作为父母本与两种杂草稻杂交获得杂交f1为试验材料，通过测定试验材料在单种自然虫压条件下的相关农艺性状，评估t2a-1与杂草稻杂交f1的适合度，分析该复合性状转基因水稻可能对生态环境造成的影响，为复合性状转基因作物安全性评价标准的制定提供理论和试验依据。
研究内容：
1.f1的鉴定：本试验以复合性状转基因水稻t2a-1和mh63与两种杂草稻杂交获得杂交f1为试验材料。由于复合转基因水稻t2a-1是由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室人工合成cry2a*，并与选择标记抗除草剂bar基因连接，运用农杆菌介导的方法转化明恢63（mh63）获得，需要筛选并检测杂交f1的抗性植株；
3. 研究的方法与方案
研究方法：以复合性状转Cry2A*/Bar基因水稻T2A-1和MH63分别作为父母本与2种杂草稻杂交F1为试验材料。通过测定试验材料在单种自然虫压条件下的相关农艺性状，通过分析携带抗性基因的F1（F1 ）与未携带抗性基因的F1（F1-）及与相应杂草稻的适合度，评估复合性状转基因水稻T2A-1的生态风险。
技术路线：
实验方案：
（1）F1鉴定：在南京农业大学牌楼教学试验基地对WRTZ、WRYY以及T2A-1和MH63与两种杂草稻的杂交F1进行育秧。
对以T2A-1为亲本的F1：在水稻秧苗生长至3-4叶期时，喷施18有效成分的草铵膦溶液150mg/L，一周后仍能正常生长的秧苗为抗性苗，枯黄秧苗则不具有抗性。待水稻幼苗生长到5叶期，用20mg/L的草铵膦涂抹其叶片，一周后仍能正常生长的秧苗为抗性苗，枯黄秧苗则不具有抗性。经过确认的抗性植株用PCR进行进一步Bar基因检测。
对以MH63为亲本的F1：使用PCR技术检测其是否含有杂草稻红色果皮基因Rc和栽培稻白色果皮基因rc，含有这两种基因则为真杂种。
（2）移栽：经杂交鉴定后，选择大小一致、生长健壮的幼苗进行移栽。幼苗种植在南京农业大学温室内，10种材料，每种材料4个重复，随机分布，小区面积为60cm×80cm，每个小区移植20株，株间距20cm，小区间距50cm。
（3）靶标虫压测定：水稻生长至孕穗期，以各小区所有材料为调查对象，统计卷叶率和枯穗率。
靶标虫压（） 卷叶率（） 枯穗率（）。
（4）适合度指标测定：水稻生长至黄熟期，测定各材料的营养指标，包括株高和单株分蘖数；水稻成熟后测定生殖指标，包括穗长、单穗饱粒数、结实率、百粒重、单株产量和单株干生物量，详见表1。
（5）落粒率的统计：每个小区选取5个单株，取其主穗从1.5m处自由坠地，连续3次，记录落粒数，计算落粒率。落粒率（） 穗落粒数 / 穗总粒数×100。
表1 单种条件下水稻适合度测定指标
| 生长阶段 Growth stage | 指标 Index | 测量方法 Method of measurement |
| 营养指标 Vegetative | 株高 Plant height | 每区选取20株水稻，测量土壤表面到主茎穗顶端的高度 Choose20 rice plants per plot , measure their heightthe soil surface to the top of main stem panicles |
| 有效分蘖数 Effective tillers per plant | 每区选取20株水稻，统计抽穗分蘖的数目 Choose20 rice plants per plot ,the number ofeffectiveheading tillers | |
| 生殖指标 Reproductive | 穗长 Panicle length | 每区选取20株水稻，测量主茎穗的长度 Choose20 rice plants per plot , measure their length of paniclesthe main culmfirst tillerat maturity |
| 单穗饱粒数 Filledgrain number per panicle | 每区选取5株，统计每株主茎穗的饱粒数， Choose5rice plants per plot ,their number of filledgrains per main stem panicle at maturity | |
| 百粒重 100-grain weight | 选取100粒饱满种子称重，每区测量5次 Measure the weight of 100 filledseeds5 times per plot | |
| 结实率 Seed-setting rate | 每区选取5株，统计每株主茎穗的饱粒数和总粒数 穗的饱粒数/穗总粒数×100 Choose5rice plants per plot ,the number of filled grainstotal grains per plant Number of filledgrains per panicle *100 | |
| 单株产量 Yield per plant | 每区测量20株水稻的产量 Choose20rice plants per plot, measure their yield | |
| 地上部单株干生物量 Dry biomass per plantshoot | 每区选取20主单株水稻，测量地上部分的干重 Choose20rice plants per plot, measure their dry weight of above-ground parts |
可行性分析：前期工作基础扎实，南京农业大学杂草研究室已对复合性状转基因生存竞争能力试验做过一定的研究，相关试验的研究方法已经成熟，积累了丰富的相关研究经验。关键技术方法成熟，本研究室具备植物实验操作技术平台，成功掌握本项目关键性技术以及相关制约性技术并加以运用，同时也具备丰富的资料资源。试验者具有一定的试验基础，对转基因水稻适合度研究有着强烈的兴趣以及求知的欲望，并具有吃苦耐劳、团结协作的美好精神。本研究具备创新的科学思维，严密的实验设计、完备的实验条件，因此本试验方案切实可行，可按预期完成。
4. 研究创新点
（1）关键问题的创新性：目前关于复合性状转基因水稻与杂草稻杂交F1的适合度研究很少，复合性状转基因作物涉及了多个外源基因的转入，相比于单性状转基因作物更为复杂，目前我国以及很多其他的国家和地区都没有针对复合性状转基因作物生态安全性的评价标准。本试验以复合性状转Cry2A*/Bar基因水稻为试验材料，通过评估其与杂草稻杂交F1的适合度，分析该复合性状转基因水稻可能对生态环境造成的影响，为复合性状转基因作物安全性评价标准的制定提供理论和试验依据。
（2）研究创新性：该研究项目的研究技术创新性表现在，首次使用复合性状转Cry2A*/Bar基因水稻T2A-1和MH63分别作为父母本与2种杂草稻杂交获得杂交F1进行适合度研究。因此本项目具有创新的整体策略以及鲜明的研究特色。
5. 研究计划与进展
2018.6-2018.7 南京农业大学牌楼基地育秧；
2018.7-2018.8 水稻秧苗移栽；
2018.9-2018.10 测定自然虫压，测量水稻株高、穗长和分蘖数；
